復方地黃顆粒治療帕金森病胃腸動力障礙

張建英，王 利，何建成*

（1.云南中醫藥大學，昆明 650500；2.上海中醫藥大學，上海 201203）

帕金森?。╬arkinson’s disease，PD）是以震顫、肌強直、運動減少和姿勢異常為特征的慢性神經系統變性疾病，但認知功能障礙、精神障礙、睡眠障礙、自主神經功能障礙和感覺障礙等非運動障礙在PD的發生率也較高[1]。在非運動癥狀的自主神經功能障礙中，以消化道功能障礙的表現較常見，流涎、吞咽困難、胃排空延遲、便秘等胃腸功能障礙嚴重影響患者的生活質量[2]。復方地黃顆粒是上海中醫藥大學何建成教授開發的臨床治療PD的有效中藥制劑。前期的研究證實，復方地黃顆粒對PD的作用機制與調控神經遞質、細胞凋亡、DA代謝、神經營養因子及部分細胞信號通路等有關，長期服用未見不良反應[3]。本實驗進一步觀察復方地黃顆粒對陰虛動風證PD病證結合動物模型并發胃腸動力障礙癥狀的治療作用，并初步探索其作用機制。報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠150只，雄性，體質量180～200 g，上海中醫藥大學實驗動物中心提供，使用許可證號：SYXK（滬）2014-0008。飼養條件：相對濕度60%～65%，恒溫（23±2）℃，自動光-暗控制（7:00—19:00光照，19:00—次日7:00暗置），動物攝食、飲水及活動自由。

1.2 試劑與儀器

戊巴比妥鈉（pentobarbital sodium），上海中西藥業股份有限公司，批號WS20130112；6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine hydrochloride，6-OHDA），Sigma 公司（美國），批號MKBJ8207V；阿撲嗎啡[R-（-）-apomorphine hydrochloride hemyhydrate，APO]，Sigma公司（美國），批號SLBG0333V；抗壞血酸（vitamin C），Selleck公司（美國），Cat No：S3114，Lot：01。磷酸鹽緩沖液（PBS），高壓滅菌（至少 20 min）保存于室溫或4℃冰箱中；EDTA（pH 9.0，×50），MVS-0098，批號160509425F；山羊血清，中杉金橋（ZLI-9021）；二步法免疫組化試劑盒，中杉金橋PV-6002 ；DAB顯色液，中杉金橋（ZLI-9019）；c-kit（D13A2）XP?Rabbit mAb，Cell Signaling Technology，Catalog number：3074，145kDa。大鼠腦立體定位儀，RWD-68003 型，深圳瑞沃德生命科技有限公司。光學顯微鏡，重慶光電儀器有限公司，型號XSP-C204；烘箱，上海精宏實驗設備有限公司，型號DGX-9003B；切片機，上海徠卡儀器有限公司，型號RM2016。

復方地黃顆粒：熟地黃、丹參、白芍、鉤藤、石菖蒲、全蝎、珍珠母，按照既定工藝制成浸膏粉（國家中藥制藥工程技術研究中心制備）。按孫瑞元《定量藥理學》的標準體質量大鼠每日用量方法計算大鼠中藥的每日用量。

2 實驗方法

2.1 陰虛動風證PD模型制備

實驗前確認參與實驗大鼠沒有自發旋轉行為。麻醉（3%戊巴比妥鈉，0.25 mL·100 g-1），固定（利用大鼠腦立體定位儀），手術（行右側黑質損毀術）。依據包新民主編的《大鼠腦立體定位圖譜》找到前囟，確定第一點坐標（前囟后 5.2 mm，中線右側1.0 mm，硬膜下9 mm），第二點坐標（前囟后5.2 mm，中線右側1.5 mm，硬膜下8.5 mm）。標記，輕緩鉆透顱骨，用微量注射器抽取6-OHDA 溶液（含0.2% 的抗壞血酸的溶液配制，濃度2 μg·μL-1），每點注射3 μL。以 1 mm·min-1速度進針，注射6-OHDA 溶液的速度為 1 μL·min-1，注射完畢留針5 min。再按 1 mm·min-1速度緩慢拔針，縫合皮膚。6-OHDA 注射 4 周后，腹腔注射阿撲嗎啡（Sigma，0.5 mg·kg-1，溶解于純凈水0.5 mg·mL-1）誘導首尾相接的左側旋轉行為，記錄開始旋轉時間和30 min內總旋轉圈數，平均每分鐘≥7 r的為模型成功[4-7]。本課題組前期從病因、癥狀、客觀指標、方證相應等方面，綜合觀察了模型動物的變化，證實該動物模型屬于陰虛動風證模型[8]。

2.2 動物分組及給藥

正常對照組，10只大鼠不造模。將造模成功的PD模型大鼠隨機分為PD模型組、中藥組，每組10只。正常對照組、PD模型組動物，均灌胃等量生理鹽水；中藥組灌胃復方地黃顆粒（0.504 g·mL-1）1 mL·100 g-1，每日1次。

給藥第6周，收集各組大鼠糞便，測定其含水量，檢測胃排空速度：胃排空率=1-（總胃重-胃凈重）/灌胃糊劑總量×100%。并剪取胃竇組織固定，留作檢測免疫組化，另一部分液氮速凍，-80℃冰凍儲存，待檢測蛋白表達。

2.3 免疫組化法檢測ICC數量

取胃竇組織（約0.5 cm），PBS沖洗干凈，4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm切片，免疫組化染色，光學顯微鏡下觀察病理改變。

胃竇組織切片常規脫蠟至水后，用Tris 鹽酸緩沖液（TBST）[ pH （7.4±0.2）] 洗3次，每次 3 min；組織抗原行水浴法熱修復；30 mL·L-1過氧化氫阻斷內源過氧化物酶，TBST洗3次；用正常非免疫動物血清室溫孵育 10 min；同一組織相鄰切片加入一抗，4℃過夜；TBST洗3次后，加入生物素標記第二抗體室溫孵育20 min；TBST洗3次，加入鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶室溫孵育20 min，二氨基聯苯胺（DAB） 顯色，中性樹膠封固。所有切片在同一條件下采用Image-Pro?Plus （IPP）分析系統分析其平均光密度值。

2.4 Western blotting法檢測c-kit蛋白表達

常規蛋白質抽提，行Western blotting分析。采用Alpha View SA圖像分析軟件對目標條帶進行灰度分析，以β-actin為參照計算相對表達量。

2.5 統計學方法

3 實驗結果

3.1 糞便含水量測定與胃排空率比較

與正常對照組比較，陰虛動風證PD病證結合動物模型組大鼠糞便含水量明顯降低（P＜ 0.05）；與模型對照組比較，復方地黃顆粒組大鼠糞便含水量顯著增加（P＜0.05）。與正常對照組比較，陰虛動風證PD病證結合動物模型組大鼠胃排空率明顯降低（P＜0.05）；與模型對照組比較，復方地黃顆粒組大鼠胃排空率明顯增加（P＜0.05），與正常對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠糞便含水量與胃排空率比較（±s，n=10） %

表1 各組大鼠糞便含水量與胃排空率比較（±s，n=10） %

注：與正常對照組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別 糞便含水量 胃排空率正常對照組 60.21±2.53 61.84±7.38模型組 44.42±3.15# 45.53±5.36#復方地黃顆粒組 62.85±4.51△ 59.45±6.84△

3.2 胃竇部C-kit免疫反應陽性細胞ICC數量

在×400鏡下，每個部位每個層次隨機選取10個視野，計數ICC陽性胞體個數之和。免疫組織化學法染色后ICC呈現棕黃色，分布在肌間、肌內、黏膜下、深肌層，為梭形、圓形、多角形和不規則形等，高倍光鏡下容易辨別。與正常對照組比較，陰虛動風證PD病證結合動物模型組大鼠胃竇部C-kit免疫反應陽性ICC數量明顯降低（P＜0.05）；與模型對照組比較，復方地黃顆粒組大鼠胃竇部C-kit免疫反應陽性ICC數量明顯增加（P＜0.05），與正常對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠胃竇全層ICC數量、c-kit蛋白表達比較（±s，n=5）

表2 各組大鼠胃竇全層ICC數量、c-kit蛋白表達比較（±s，n=5）

注：與正常對照組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別 胃竇ICC數量 胃竇c-kit蛋白表達正常對照組 231.05±26.25 0.65±0.09模型組 186.45±26.72# 0.28±0.16#復方地黃顆粒組 236.18±27.53△ 0.62±0.13△

3.3 胃竇c-kit蛋白表達結果

與正常對照組比較，陰虛動風證PD病證結合動物模型組大鼠胃竇部 c-kit蛋白表達量明顯降低（P＜0.05）；與模型對照組比較，復方地黃顆粒組大鼠胃竇部 c-kit蛋白表達量明顯增加（P＜0.05），與正常對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。見表2，圖1，圖2。

圖1 陰虛動風證PD大鼠胃竇c-kit蛋白表達變化及復方地黃顆粒的干預作用

圖2 各組大鼠胃竇c-kit蛋白表達比較

4 討論

復方地黃顆粒由熟地黃、鉤藤、珍珠母、白芍、丹參、石菖蒲、全蝎等藥物組成，諸藥合用，滋補肝腎，熄風化痰，散結活血，平肝解毒，對PD運動障礙及部分并發癥有較好療效?；谇捌谂R床觀察服用該方的PD患者排便通暢，本次實驗觀察其對實驗大鼠胃排空、糞便含水量等的作用，并初步探討其部分機制。

近年來，胃腸動力細胞與胃排空延遲、便秘、腹瀉等胃腸動力障礙疾病間的關系備受關注[9]。Cajal間質細胞（interstitial cells of Cajal，ICC）是一組存在于胃腸道的間質細胞，是胃腸起搏細胞，自發產生慢波并傳播至平滑肌細胞，調控胃腸平滑肌的收縮節律[10]。腸運動神經細胞釋放出的多數神經遞質與ICC表達的受體結合，亦產生興奮或抑制性反應[11]。研究[12]發現c-kit是ICC表面的標記物。

PD患者常伴發胃排空延遲、便秘等癥狀，本次實驗觀察到陰虛動風證PD病證結合模型動物胃排空率、糞便含水量降低，與PD臨床常伴發癥狀一致；復方地黃顆粒組實驗動物胃排空率、糞便含水量增加，接近正常對照組。進一步觀察大鼠胃竇部ICC的相關蛋白c-kit的表達，并且以免疫組化的方法標記ICC數量，結果顯示模型組胃竇c-kit蛋白表達減少，ICC數量減少，而復方地黃顆粒組c-kit蛋白表達增加，ICC數量增多。推測該方改善PD便秘癥狀的作用與c-kit蛋白及其標記的ICC有關。復方地黃顆粒是基于PD的神經運動障礙等進行辨證處方，并非針對胃腸系統直接選方用藥，本結果卻顯示其有效緩解PD伴發的胃腸動力障礙的癥狀，發揮了中藥在臨床應用中的多方面功效。相關研究還有待于繼續探索。