肝缺血再灌注在不同階段的損傷機制和臨床治療策略

杜施嘉，吳紅茜，史廣江，楊勇

(1.中國藥科大學藥物科學研究院，江蘇 南京 211198；2.中國藥科大學藥學院，江蘇 南京 211198；3.中國藥科大學基礎醫學與臨床藥學院，江蘇 南京 211198)

肝病是一種會導致死亡的高危疾病，每年有80多萬人因肝病死亡。據統計，高達25%的世界人口具有患肝病的風險，導致這些風險的因素包括病毒感染、酗酒和非酒精性脂肪性肝炎等，這導致了原發性肝癌的高發病率。在大多數情況下，治療終末期肝病的唯一方法是肝移植[1]。然而，肝移植伴隨著缺血-再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)的風險。肝臟IRI是器官的血液供應中斷后重新恢復血供時產生的組織損傷。IRI對肝功能有顯著影響并引起系統性肝損傷。肝臟IRI包括熱IRI和冷IRI—這兩種損傷具有相似的病理生理過程[2]。肝臟IRI涉及多種復雜的生物學過程，如無氧代謝、氧化應激、鈣超載、肝枯否細胞(kupffer cells,KCs)和中性粒細胞釋放細胞因子等。目前研究認為，肝臟IRI進程分為4相：Ⅰ相為缺血缺氧階段，該階段的細胞損傷主要由代謝紊亂和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)耗竭所引起，是IRI最重要的始發因素。肝臟是人體最重要的代謝器官之一，在缺血缺氧狀態下肝臟代謝迅速發生紊亂，產生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)，引起肝臟損傷。Ⅱ相即再灌注早期，這個階段巨噬細胞被激活。缺血缺氧環境誘導的代謝產物和ROS等均可以活化巨噬細胞，使其釋放大量的炎性因子和趨化因子(IL-6、TNF-α、TGF-β)等，引起肝臟炎癥反應。Ⅲ相是再灌注損傷的最重要時期，這個階段的細胞損傷主要是由中性粒細胞的大量積聚導致的。在IRI早期釋放的大量趨化因子，可導致中性粒細胞在肝臟炎性部位的積聚和活化，引起炎性級聯反應，進而導致肝竇內皮細胞和肝細胞死亡。Ⅲ相即修復階段，被激活的肝星狀細胞以及免疫細胞在IRI急性期過后，促進肝臟從IRI中恢復[3]。簡而言之，肝臟IRI影響肝移植患者的預后和生存率，極大地限制了移植手術的成功與普及，因此，目前迫切需要一種有效的方法來預防或減少肝臟手術過程中IRI的發生，更好地理解IRI的發病機制將有助于開發改善IRI的治療方案。本文詳細綜述了肝臟IRI的發生發展機制和臨床治療方法。

1 肝臟缺血再灌注在不同階段的損傷機制

1.1 缺血缺氧階段 在缺血缺氧階段，細胞的營養和氧氣供應不足，在這一階段肝臟細胞受損的機制主要包括細胞內代謝紊亂和細胞內發生鈣超載，線粒體受損，導致ROS大量產生。

1.1.1 細胞代謝紊亂 在缺氧最早期，受損細胞的線粒體首先受到影響。由于氧氣是線粒體呼吸鏈最末端電子載體，在缺氧發生時，線粒體中的電子流被中斷，導致呼吸效率降低[4]。此時線粒體不再接受來自底物的電子，細胞內的吡啶核苷酸被還原，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原態/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸比值增加。氧化磷酸化的突然中斷導致ATP的迅速耗竭，不僅促進了糖酵解，增加了乳酸的形成，還破壞了H+、Na+和Ca2+的穩態[5]，改變了細胞糖代謝的方式，進而對肝細胞造成了嚴重損傷。缺血還導致了環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的大量增加，cAMP是影響葡萄糖代謝的重要因素[6-7]。cAMP依賴性蛋白激酶控制著碳水化合物代謝的多種關鍵酶，包括糖原磷酸化酶，6-磷酸果糖-2-激酶/果糖2，6雙磷酸酶或L型丙酮酸激酶等發生磷酸化，這些酶的活性變化致使糖代謝的方式發生改變[6,8-9]。

這一階段除了糖代謝的方式發生了改變外，細胞的脂質代謝也出現了紊亂，參與脂質代謝相關酶的活性也發生改變。機體的脂質代謝紊亂是肝臟IRI的早期決定性觸發因素。有研究發現花生四烯酸代謝途徑中的12-脂氧化酶(12-lipoxygenase,ALOX12)及其代謝物12-羥基二十烷四烯酸(12-hydroxyeicosatetraenoic acid,12-HETE)在缺血期肝臟中表達上調。ALOX12抑制劑ML155可顯著改善肝臟IRI，通過調節ALOX12-12-HETE軸影響肝臟IRI[10]。脂肪對于IRI的影響還體現在脂肪的過氧化反應方面，脂質過氧化作用會產生ROS并增強肝臟IRI[11]。脂質過氧化作用消耗煙酰胺腺嘌呤二核苷酸,并增加煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原態/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的比例，促進了ROS的產生[12]，誘導線粒體表達線粒體解偶聯蛋白2(uncouplingprotein 2,UCP2)，UCP2導致細胞呼吸中質子梯度的泄漏，從而減少了ATP的產生，進而促使細胞轉向無氧呼吸[13]。這些機制也解釋了為什么供體器官脂肪含量過高會帶來更高的臨床風險。

1.1.2 氧化應激 在缺氧階段，線粒體的電子傳遞鏈中斷，從而抑制了細胞內氧化磷酸化和ATP的合成，線粒體的三態呼吸被抑制，使得肝臟局部產生大量ROS[14]，這也是導致肝臟損傷的重要因素。除此之外，ATP的產生減少導致鈣泵的活力不足，鈣離子無法主動轉移至細胞外，同時內質網攝取鈣離子的能力下降，導致細胞內鈣離子超載。此時，線粒體膜的通透性發生改變，線粒體內的鈣離子釋放入細胞質中，造成了線粒體嵴和外膜損傷[15]，細胞色素C(cytochrome C,Cyt-c)等一系列蛋白被釋放，而缺乏了Cyt-c的線粒體在有氧條件下由于電子傳遞受阻產生大量ROS[16]。在再灌注階段，氧氣可以催化缺血階段所生成的大量黃嘌呤氧化酶，產生大量的ROS。由于缺血階段線粒體受到損傷，導致了有氧條件下大量ROS的產生。ROS一方面本身即可介導NF-κB的激活，導致后續炎癥因子的釋放，另一方面，ROS能促進高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)的釋放，激活HMGB1/Toll樣受體4/NF-κB信號通路，進而促進大量炎癥因子的釋放(IL-1β、IL-6、TNF-α和TNF-β)，導致細胞受損[17-18]。

1.2 再灌注階段 再灌注分為早期再灌注和晚期再灌注階段。缺血階段產生的ROS和炎癥因子刺激再灌注早期階段KCs的活化。KCs分泌的一些細胞因子招募大量中性粒細胞聚集到肝臟受損部位。募集的中性粒細胞在晚期再灌注階段所導致的肝損傷中發揮著巨大作用。此外，再灌注階段，細胞自噬被啟動，參與調節肝臟IRI。

1.2.1 免疫細胞和炎癥因子 在早期灌注階段，KCs發揮了巨大作用。KCs是位于肝血竇部位的巨噬細胞，屬于單核細胞。在肝臟正常工作時，KCs是耐受性反應的核心：KCs通過阻斷肝臟的循環抗原，將其呈現給T細胞，并誘導耐受性T細胞的擴增，進而導致免疫抑制細胞因子如IL-10的產生[19]。然而在肝損傷期間，KCs失去了這種特性，轉而誘發損傷部位炎癥反應[20]。

在IRI期間，損傷的肝臟細胞會釋放與損傷相關的分子模式，KCs通過表達Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)3、4和9識別這些損傷信號。TLR尤其是TLR4的激活，將KCs產生的細胞因子推向炎癥表型[21]。在早期再灌注階段，KCs分泌大量ROS和促炎細胞因子(IL-1β、TNF-α、IFN-γ和IL-12)從而對肝細胞造成損傷，其中IL-1β和TNF-α促進中性粒細胞黏附和向肝實質外滲[22]。TNF-α不僅可以誘導肝竇內皮細胞表面P-選擇素的上調，促進血小板黏附和活化，還可以促進KCs分泌趨化因子[23]。趨化因子CXCL1、2和3的釋放導致中性粒細胞向受損肝組織的遷移增加[24]。

KCs是肝臟IRI的中樞調節因子，而中性粒細胞則是造成損傷的主要因素。在再灌注期間，大量中性粒細胞被募集到肝臟受損部位并被激活，加劇肝臟IRI。

中性粒細胞誘導的肝損傷是一個多步驟的過程，包括中性粒細胞的激活、招募、遷移、與肝實質細胞的接觸以及顆粒酶的釋放等[25]。趨化因子是招募中性粒細胞的最有效的“誘導劑”，趨化因子與白細胞上的G蛋白偶聯受體以及內皮細胞上表達的糖胺聚糖相互作用，在炎癥部位產生濃度依賴性的趨化因子梯度[26]，以此對中性粒細胞進行募集。除此之外，補體蛋白C3a和C5a[27-28]，線粒體衍生的甲酰基肽和白三烯B4[29-30]均可招募中性粒細胞。此外，受損肝細胞釋放的DNA與中性粒細胞上的TLR9相結合，通過TLR9/NF-κB通路進一步促進了中性粒細胞的募集以及中性粒細胞介導的細胞因子釋放[31-32]。在TLR9敲除的小鼠中，經過缺血-再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)處理后，與對照組相比小鼠的肝損傷情況得到減輕，血清中谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)和炎性因子減少，表明中性粒細胞上的TLR9受體在介導肝臟IRI中起到關鍵作用[32]。中性粒細胞被招募到肝臟部位后，黏附于靶細胞誘導其脫粒，同時釋放蛋白酶(彈性蛋白酶，基質金屬蛋白酶9，組織蛋白酶G)和ROS，這些物質擴散到肝細胞中，會引起細胞內氧化應激、線粒體功能障礙和損傷[33]。有研究發現，使用中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑西維來司能改善小鼠肝臟IRI[34]。

1.2.2 自噬 自噬是細胞質物質(包括細胞器)到達溶酶體進行降解的過程。在肝臟I/R期間，細胞內線粒體功能受損[35]，自噬通過清除異常或功能障礙的線粒體，來確保細胞功能的正常。當自噬受損時，受損的線粒體積累在細胞中，產生大量ROS，線粒體DNA發生突變、能量衰竭，最終導致細胞死亡。細胞的死亡信號分子從一個線粒體向鄰近線粒體釋放，可迅速將這種有害信號傳播到整個細胞[36-37]。因此，在I/R過程中，即使只有一小部分的受損線粒體沒被清除也會對肝細胞的功能和生存能力產生顯著影響。因此，自噬對肝臟I/R后的肝功能和細胞存活至關重要[38]。

缺血時，肝細胞缺乏營養，導致酸中毒和ATP耗竭。雖然饑餓會迅速刺激正常肝臟細胞的自噬，但由于自噬是一個高度依賴能量的過程，缺血期間ATP的缺乏會抑制自噬的激發[39-40]。長期缺血也會顯著降低關鍵自噬蛋白ATG7和BECN1的水平，這反過來又會進一步降低自噬功能[40]。隨著ATP耗竭和ATG的下調，自噬小泡的形成受到阻礙，使得自噬流在長期缺血期間最小化[41]。

在再灌注過程中，肝細胞內pH值和氧氣供應恢復。在再灌注的早期，線粒體暫時復極化，開始產生ATP，從而誘導自噬[39-40]。同時，缺血肝細胞的再灌注會觸發線粒體中Ca2+和ROS的積累[41]。當自噬的增加不足以中和再灌注應激時，會發生顯著的肝細胞損傷，而當自噬的清除能力抵消或超過再灌注誘導的線粒體損傷時，受損的線粒體能被自噬及時清除，肝細胞活力得以維持[38]。當線粒體內Ca2+和ROS負荷在后期超過自噬清除能力時，自噬不能清除所有功能障礙的線粒體時，大批線粒體發生通透性轉換(mitochondrial permeability transition,MPT)。MPT導致細胞內發生不可逆的氧化磷酸化解耦，ATP耗竭，最終導致肝細胞死亡。缺血前禁食、ATG7或BECN1過表達都可以作為增強自噬的策略從而抑制MPT，增加再灌注后肝細胞的存活率[39]。因此自噬受損或不足是肝臟IRI的一個重要機制。

1.3 腸道微生物群 肝臟IRI的一個新興領域是研究腸道微生物群對肝損傷的影響。在小鼠IRI模型中，阻斷門靜脈循環會導致腸屏障功能受損并增加細菌和細菌碎片向門靜脈循環的轉移。這導致TLR4活化，促進再灌注后的炎癥級聯反應并增加肝損傷[42]。有研究表明，去除細菌、消除TLR4信號和缺血預處理都可以降低腸道微生物群對肝臟IRI的負面影響[43]。目前臨床上有肝移植患者在移植前接受了10 d以上的抗生素處理后，發現其肝細胞功能得到改善，早期移植物功能障礙的發生率降低[44]。這項研究強調了抗生素治療在保留肝細胞功能方面以前未被重視的益處，抗生素治療可能為肝移植中治療IRI提供新的治療手段，但對于抗生素的選擇、劑量、給藥途徑和治療周期等，未來還需要進一步的去探索。

2 臨床治療現狀和所遇到的問題

臨床上對肝IRI的治療一般分為三大類：外科手術、藥物治療和基因治療。

2.1 外科手術 目前臨床上經常使用的方法是缺血預處理和間歇鉗夾[45]。缺血預處理是指在實際手術前的一段短時間的I/R，以觸發肝臟的防御機制，增強肝臟對I/R的耐受性[46]。臨床上已經證明了缺血預處理是通過一些分子來改善肝臟IRI，在其中發揮作用的包括腺苷[46]、NO[47]、氧化應激、一些熱休克蛋白(Hsps)[48]和TNF-α[49]等。

間歇鉗夾是通過多個短間隔來進行再灌注的，以此避免缺血期過長所引起的損傷[50]。盡管其保護機制仍然模糊，但間歇鉗夾目前在臨床上已被廣泛使用。對于較長的缺血間隔，間歇鉗夾有顯著的保護作用。當缺血間隔小于60 min時，應優先選擇缺血預處理，因為在使用間歇鉗夾時，每一段再灌注都可能導致顯著出血[45]。

除此之外，臨床上經常使用體外機器灌注，目的是阻止生物降解，通過持續提供移植物的基本底物(例如葡萄糖、氨基酸、核苷酸、氧氣)以及對有毒代謝物的處理，改善器官的生存能力[51]。機器灌注又可以分為低溫機器灌注和常溫機器灌注，常溫機器灌注旨在通過使用充氧的血液灌注液或人工氧載體來最大限度地降低藥物的毒性，而低溫機器灌注則依賴于使用人工低溫充氧灌注液[52]。然而，由于所涉及技術比較復雜，很難在更大范圍內被應用。

2.2 藥物治療 目前臨床上嘗試使用一些抗氧化和抗炎的藥物來改善肝臟IRI。褪黑素是一種由松果體所產生的激素，有助于調節晝夜節律，具有抗氧化活性[53]。臨床研究表明，褪黑素的保護作用在于其可促進中性粒細胞的凋亡[54]。維生素E和抗壞血酸也是重要的抗氧化劑。臨床上對肝切除患者，再灌注前輸注醋酸α-生育酚(10 mg)和抗壞血酸(1 g)可明顯改善肝臟IRI[55]。左旋多巴、N-乙酰半胱氨酸等抗氧化劑都在臨床被證明有減輕肝臟IRI的作用[56-57]。以上研究指出抗氧化劑的使用具有很大的臨床應用前景。

抗炎類藥物的作用主要是抑制炎癥因子和免疫因子，布西拉明其作為一種鎮痛消炎藥可以有效降低肝移植后患者體內AST的表達，并改善預后[58-59]。類固醇類藥物通過其抗炎作用對肝臟也具有保護作用[60]。缺血前用甲潑尼龍預處理可提高動物存活率并減少肝臟損害，皮質類固醇已被用于抑制炎癥，并被用于改善肝臟IRI[61]。但僅用類固醇類藥物進行處理是不夠的，一個有趣的策略是直接使用氯化釓來抑制KCs的活化。這種藥物在肝臟移植的動物模型中減少了肝損傷的標記物并改善了肝臟血流量[62-63]，但目前還沒有相關的人類臨床試驗數據。

2.3 基因治療 近年來，基因治療為減輕或抑制肝臟IRI提供了新的手段。然而，在大多數情況下，供肝者只有有限的時間來進行基因治療[45]。抗凋亡蛋白Bcl-2是Bcl-2家族中最具代表性的成員，在長時間肝缺血的小鼠模型中，該蛋白的過表達(通過腺病毒轉染)可以有效改善肝臟IRI[61]。抗氧化基因的基因療法最近也被用作治療肝臟IRI[64]，但這些療法都缺乏臨床上有力的數據支持，因此還需要進一步的研究。除此之外干細胞療法因其抗氧化，免疫調節和抗凋亡特性成了改善肝臟IRI的創新方法[65]。

3 展望

肝臟IRI是一個嚴重的臨床問題，影響著數百萬肝病病人的健康。在過去的十年中，深入的研究揭示了肝臟IRI的機制，并提供了許多潛在的診斷生物標志物和治療靶點。缺血預處理和改善灌注方式目前是臨床上減輕肝臟IRI效應的有效策略。此外，大批動物實驗說明抗氧化劑、自由基清除劑和炎癥抑制劑以及一些多靶點抑制劑的應用可用于保護肝細胞在肝I/R發生時免受凋亡和壞死。隨著對其機制的深入研究和針對其靶點藥物的不斷開發，未來肝臟IRI將會進一步得到改善。