高脂對骨骼肌細胞miR-27a、生物鐘基因及胰島素敏感性的影響

王賽飛，鄭路，任艷琦，喬博，吳靜，張好好

(1.鄭州大學第一附屬醫院 a.內分泌科;b.小兒內科，河南 鄭州 450052；2.長治醫學院附屬和平醫院 內分泌科，山西 長治 046000)

流行病學調查顯示，肥胖及2型糖尿病等代謝性疾病已成為威脅全球的公共健康衛生問題[1]，胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是這些代謝性疾病重要的病理基礎之一。骨骼肌是全身IR和2型糖尿病發展的關鍵，是胰島素依賴性葡萄糖攝取的主要部位(75%～90%)[2]。據報道，營養過剩、環境光污染、睡眠時間或質量下降、時差和輪班工作導致的生物鐘紊亂與IR有關，甚至直接誘發IR[3]。生物鐘廣泛分布于機體各組織器官，生物鐘分子機制的核心是Bmal1和Clock形成的異二聚體轉錄因子復合物(Clock/Bmal1)[3-5]。研究表明，Bmal1、Clock蛋白水平的下調與骨骼肌IR有關，Bmal1siRNA或ClocksiRNA可誘導C2C12肌管細胞IR[3]。體內實驗表明，高熱量飲食可影響嚙齒類動物肝臟生物鐘基因振蕩及功能[5]，而能量過剩對骨骼肌生物鐘的具體影響及其與胰島素敏感性的關系，目前研究仍未明確。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一種短鏈非編碼RNA，通過在轉錄后與靶基因結合，降解或阻遏靶mRNA的翻譯，進而參與調控靶基因表達[6]。miRNA廣泛參與調控多種生命活動，其中miR-27a在胰島素敏感性及細胞分化等多個生理過程中發揮重要作用[7]。既往研究表明miR-27a在肥胖患者血清中高表達[7]，大鼠骨骼肌L6細胞miR-27a過表達可導致葡萄糖消耗及攝取能力下降[8]。近期研究提示miRNA參與晝夜節律的轉錄后調控[9]。miR-27a是參與哺乳動物晝夜節律的候選miRNA[10]。因此，推測高脂誘導的骨骼肌IR可能與晝夜節律紊亂和miR-27a的異常表達有關。然而，高脂對骨骼肌miR-27a表達的影響尚不清楚。因此，本研究旨在觀察高脂對骨骼肌核心生物鐘基因Clock、Bmal1及miR-27a表達及胰島素敏感性的影響，為進一步了解營養狀況影響骨骼肌胰島素敏感性的具體機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料C2C12成肌細胞(中國科學院細胞庫)、棕櫚酸(Sigma)、DMEM(BI)、胎牛血清(BI)、馬血清(BI)、葡萄糖測定試劑(Sigma)、小鼠MyoD1多克隆抗體(Abcam)、小鼠Akt多克隆抗體(Cell Signaling)、p-Akt多克隆抗體(Cell Signaling)、油紅O染料(索萊寶)、CCK8檢測試劑盒(索萊寶)、激光掃描共聚焦顯微鏡(OLYMPUS)。

1.2 細胞培養及處理小鼠C2C12成肌細胞在體積分數為10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)DMEM培養液中培養，置于37 ℃、體積分數為5%CO2培養箱中進行孵育，2～3 d傳代1次。當細胞融合至90%時，換用體積分數為2%馬血清的DMEM分化培養液進行分化誘導，2 d換液1次，分化4～7 d。將處于對數生長期C2C12肌管細胞按每孔104接種于12孔板，隨機分為正常對照組(Con)、棕櫚酸組(PA組，0.75 mmol·L-1)。棕櫚酸干預16 h后收集細胞待測。

1.3 免疫熒光采用體積分數為4%的多聚甲醛固定細胞，以PBS浸洗玻片3次，每次3 min；用體積分數為0.5%的Triton X-100室溫通透20 min，清洗3次；在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；加一抗(1∶200)并放入濕盒，4 ℃孵育過夜；棄一抗，滴加熒光二抗，濕盒中37 ℃孵育1 h，以PBS浸洗切片3次；滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核，采用PBST(5 min×4次)洗去多余的DAPI。于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

1.4 CCK8試驗嚴格按照CCK8試劑盒說明進行操作。用體積分數為10%FBS培養液配成單個細胞懸液，以每孔103～104個細胞接種到96孔板，每孔100 μL；培養3～5 d后，加入CCK8溶液10 μL。繼續孵育4 h。用酶聯免疫檢測儀測定在450 nm處的吸光度，記錄OD值，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.5 葡萄糖消耗采用葡萄糖氧化酶法測定每孔培養液中的葡萄糖含量。葡萄糖消耗等于不含細胞的培養孔內培養液中的葡萄糖含量減去培養孔培養液中剩余葡萄糖含量。具體操作步驟詳見試劑盒。

1.6 實時熒光定量PCR采用Trizol法提取總RNA并定量，反轉錄為cDNA，引物均由蘇州金唯智有限科技公司設計合成，引物名稱及序列見表1。將cDNA按實時熒光定量PCR反應體系(20 μL)反應，PCR過程如下。95 ℃預變性3 min。延伸40個循環：95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s。解離：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。以GAPDH和U6作為內參基因進行標準化。見表1。結果采用結果2-△△ct法進行計算。

1.7 Western blot取細胞總蛋白，用BCA法測蛋白含量。用體積分數為10%的SDS-PAGE電泳，后將蛋白轉移至NC膜上，用含50 g·L-1脫脂牛奶封閉，分別加入兔抗Akt(1∶1 000)、p-Akt(Ser473)(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日，以TBST洗滌3次，加入稀釋好的二抗，避光室溫下孵育1～2 h。采用Bio-Rad紫外凝膠成像分析系統進行吸光度掃描。采用Image J軟件計算灰度值。

2 結果

2.1 骨骼肌C2C12肌管的形態學變化細胞在分化前呈梭形或不規則三角形，細胞間有一定的間隙，排列不規則。分化7 d后，細胞間隙縮小，邊界清晰，肌管形態特征明顯。免疫熒光結果顯示，分化前肌管形成標志蛋白MyoD1未表達，分化后MyoD1表達明顯，且形態呈現肌管狀，提示小管形成，具有骨骼肌生物學特性，可用于后續實驗。見圖1。

2.2 高脂對骨骼肌C2C12細胞活力的影響考慮到棕櫚酸對細胞的毒性，為排除骨骼肌細胞活力下降對實驗結果的影響，行CCK8增殖實驗，結果顯示，0.75 mmol·L-1PA干預16 h后，兩組OD值比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3 高脂對骨骼肌胰島素敏感性的影響Western blot法結果顯示，與對照組相比，PA組p-Akt/Akt水平較低(P<0.001)。見圖2A。油紅O染色結果顯示，PA干預增加了C2C12肌管細胞的脂質含量。見圖2B。PA組C2C12細胞葡萄糖消耗量較對照組少(P<0.001)。見表3。

圖2 棕櫚酸對骨骼肌C2C12細胞胰島素敏感性的影響

2.4 高脂對骨骼肌miR-27a和生物鐘基因的影響采用實時熒光定量PCR檢測高脂對骨骼肌核心生物鐘基因的影響。PA組生物鐘核心基因ClockmRNA及Bmal1mRNA表達水平較對照組低，miR-27a表達水平較對照組高(P<0.05)。見表4。miR-27a與ClockmRNA及Bmal1mRNA呈負相關(r=-0.847、-0.662，P<0.05)。見圖3。

A為miR-27a水平與Clock mRNA表達水平相關性；B為miR-27a水平與Bmal1 mRNA表達水平相關性。

3 討論

隨著我國社會工業化的不斷推進，國民對24 h消費服務的需求不斷增加。據統計，亞洲至少有30%的工作人員參與輪班工作[11]。研究顯示，連續5周24 h持續光照可使小鼠脂肪含量顯著增加57%，且光照持續時間與脂肪細胞的數量和大小呈正相關[12]，提示晝夜節律紊亂促進肥胖發生。此外，飲食結構改變尤其高脂飲食也是肥胖發生的重要因素。然而，高脂對骨骼肌生物鐘的影響尚不清楚。本研究發現，PA干預降低骨骼肌p-Akt表達和葡萄糖消耗，同時增加異位脂質沉積。此外，PA組骨骼肌ClockmRNA及Bmal1mRNA表達水平較對照組低，miR-27a表達水平較對照組高，進一步分析表明miR-27a與ClockmRNA及Bmal1mRNA呈負相關。這提示棕櫚酸誘導的骨骼肌IR與生物鐘紊亂有關，且可能由miR-27a介導。

骨骼肌是胰島素刺激狀態下葡萄糖攝取的主要部位，骨骼肌IR被認為是代謝綜合征發病的早期因素之一[2,13]。C2C12成肌細胞是肌肉重建的前體細胞，需進一步分化為肌管才具有骨骼肌生物活性，是體外研究骨骼肌的理想模型。免疫熒光結果顯示，分化后肌管形態明顯，MyoD1高表達。進一步細胞活力測定表明，PA處理16 h對細胞活力無明顯影響。另一項研究表明，低于0.6 mmol·L-1的PA并不能抑制C2C12肌管的細胞活力，而高于0.8 mmol·L-1的PA具有顯著的抑制作用[14]。然而，Meshkani等[15]發現0.75 mmol·L-1PA處理C2C12肌管24 h后，細胞活力降低至對照組的43%，可能為PA對細胞的損傷作用具有劑量依賴性和時間依賴性。此外，PA能下調骨骼肌細胞p-Akt蛋白水平和葡萄糖消耗，提示高脂干預導致骨骼肌IR。

轉錄-翻譯反饋環路是構成生物節律的分子基礎，其核心是Clock/Bmal1[3-5]。研究顯示Clock/Bmal1可調節小鼠胰島素敏感性的晝夜變化[3]，Clock和Bmal1突變體均表現出糖耐量受損、胰島素分泌減少[16]。研究表明，高脂肪飲食(60%脂肪)僅3 d即可在不引起肥胖的情況下使小鼠肝臟晝夜節律重新編程[17]。另一項研究提示，高脂和高糖均下調C2C12細胞核心生物鐘基因mRNA表達，但高脂下調作用更為顯著[18]。這提示Clock和Bmal1與系統胰島素敏感性密切相關，且脂質變化對晝夜節律功能有重要影響。然而，高脂對骨骼肌晝夜節律的具體影響尚不清楚。本研究數據顯示，0.75 mmol·L-1PA下調C2C12細胞ClockmRNA和Bmal1mRNA表達。然而，0.4 mmol·L-1和50 μmol·L-1PA分別處理人原代肌管細胞[19]和AML-12[5]后，Bmal1mRNA表達未見明顯變化，可能與飲食中脂肪占比和PA水平有關，脂肪在總攝入量中的占比越高，水平越高，對晝夜節律的不良影響越明顯。

為進一步探討高脂誘導IR與核心生物鐘基因的關系，檢測miR-27a在C2C12肌管中的表達水平，發現PA組miR-27a表達水平較高。對哺乳動物中保守miRNA的預測分析表明miR-9、miR-24、miR-25、miR-26、miR-27、miR-29、miR-93、miR-211是晝夜節律的候選miRNA，且miR-27在人類白細胞中呈現節律性表達[10]，提示miR-27可能參與生物節律的轉錄后調控。然而，目前尚未有研究證實miR-27a在骨骼肌生物鐘紊亂誘導的IR中的作用。miR-27a與Bmal1mRNA和ClockmRNA的相關性分析表明，miR-27a與ClockmRNA和Bmal1mRNA呈負相關，提示PA所致晝夜節律紊亂可能通過miR-27a引起骨骼肌IR。

綜上所述，高脂可導致骨骼肌晝夜節律紊亂和IR，該過程可能與miR-27a的異常表達有關，提示miR-27a可能是一個整合晝夜節律和胰島素敏感性的新節點。然而，本研究仍存在一定的局限性：首先，未建立生物鐘紊亂模型來觀察miR-27a的表達；其次，未干預miR-27a從而證明高脂通過miR-27a誘導IR，這也是下一步的研究方向。總之，本研究為協調骨骼肌的晝夜節律和能量代謝提供了新方向，為研究與晝夜節律紊亂相關的骨骼肌IR提供了新策略。