miR-26-5p靶向PTEN基因調控軟骨細胞的增殖和凋亡

崔宏宇，陳云輝，吳治偉，鄭博元

(1.廣州市番禺區中心醫院 創傷骨科，廣東 廣州 511400；2.暨南大學附屬第一醫院 骨關節科與運動醫學中心，廣東 廣州 511400)

骨關節炎是一種關節的慢性、退行性疾病，其特征在于軟骨損傷、軟骨下骨增生、滑膜炎和其他關節組織變化。目前研究顯示，軟骨細胞是軟骨中唯一的細胞，軟骨細胞的增殖及凋亡參與骨關節炎的發生和進展[1]。微小RNA(miRNA)是長度為22 nt的非編碼單鏈RNA分子家族，多種miRNA參與骨關節炎的發病機制[2]。最近研究發現，miR-26-5p參與骨關節炎的發病及進程[3]。PTEN能夠調控細胞增殖、分化及凋亡過程，是一類抑癌因子。近期研究顯示，PTEN與骨關節炎的發生密切相關[4]。據報道，miR-26-5p能夠調節腫瘤細胞中PTEN的表達[5]。然而，miR-26-5p是否能調節軟骨細胞中PTEN的表達，參與軟骨細胞增殖和凋亡的調控尚不清楚。因此，本研究探討miR-26-5p靶向調節PTEN的表達對軟骨細胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑人膝關節軟骨細胞(上海生工)；DMEM/F12培養基(美國Gibco)；噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)(美國Sigma)；miR-26-5p mimics、miR-26-5p 抑制物及陰性對照(上海吉瑪)；Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑(美國Invitrogen)； SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(日本TaKaRa)；RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒(北京康為世紀)；AnnexinⅤ-FITC/PI檢測試劑盒(上海貝博生物)；熒光素酶報告基因重組載體構建由上海吉瑪完成；電化學發光(electro chemi luminescence，ECL)試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Promega)；BCA檢測試劑盒和細胞裂解液(上海碧云天)；PTEN抗體、GAPDH抗體及辣根過氧化物酶標記的IgG(美國Abcam)。

1.2 細胞培養和轉染人軟骨細胞接種在DMEM/F12培養基(體積分數為10%的胎牛血清)中，置于體積分數為5%的CO2、37 ℃培養箱培養。待細胞生長達90%匯合時，以胰蛋白酶消化，按1∶3進行傳代。傳代后的軟骨細胞接種到96孔板中，將軟骨細胞分為3組：anti-miR-26-5p組軟骨細胞轉染miR-26-5p抑制物，anti-miR-NC組軟骨細胞轉染陰性對照，對照組軟骨細胞不做轉染處理，細胞轉染依據Lipofectamine 2000轉染試劑使用說明進行。

1.3 實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR)檢測細胞中miR-26-5p表達量使用RNA提取試劑盒抽提轉染48 h后3組軟骨細胞總RNA，將RNA逆轉錄成cDNA，將cDNA作為模板，行qRT-PCR檢測，反應條件設置為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共設40個循環。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算各組軟骨細胞中miR-26-5p相對表達量。

1.4 MTT法檢測各組軟骨細胞增殖活力將對照組、anti-miR-NC組和anti-miR-26-5p組軟骨細胞接種到96孔板中，接種密度為每孔3×103個，分別在轉染24、48、72 h時加入MTT試劑，4 h后再加入150 μL DMSO，至沉淀完全溶解后使用酶標儀測定波長為450 nm處吸光度值。

1.5 流式細胞術檢測軟骨細胞凋亡率轉染48 h后的軟骨細胞采用PBS洗滌3次，進行胰酶消化、離心并收集軟骨細胞，加入AnnexinⅤ-FITC和PI染液，孵育15 min，采用流式細胞儀檢測，采用Cell Quest軟件分析軟骨細胞凋亡率。

1.6 雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-26-5p和PTEN的靶向關系TargetScan在線數據庫預測結果顯示出miR-26-5p和PTEN3’UTR存在結合位點，根據預測結果分別構建PTEN野生型(PTEN-wt)和PTEN突變型(PTEN-mut)的熒光素酶報告基因重組載體質粒。將PTEN-wt和PTEN-mut質粒分別與miR-26-5p mimics或mimics對照共轉染軟骨細胞，用試劑盒測定軟骨細胞的相對熒光素酶活性。

1.7 Western blot檢測PTEN蛋白表達分別收集轉染48 h后對照組、anti-miR-NC組和anti-miR-26-5p組軟骨細胞，抽提總蛋白。以BCA法測定蛋白質水平，等量蛋白樣品加樣后，行SDS-PAGE凝膠電泳，隨后轉印至硝酸纖維素膜上，封阻2 h，加入1∶1 000稀釋的PTEN一抗，4 ℃過夜雜交，加入1∶3 000稀釋的二抗，雜交2 h，以ECL顯色，使用凝膠成像系統掃描膠片，以GAPDH標定，采用Image J軟件分析條帶灰度值，計算PTEN蛋白的表達水平。

2 結果

2.1 轉染miR-26-5p抑制物可抑制軟骨細胞中miR-26-5p的表達在軟骨細胞中轉染miR-26-5p抑制物及陰性對照48 h后，qRT-PCR檢測結果顯示，anti-miR-26-5p組軟骨細胞中miR-26-5p的表達量(0.26±0.03)均較對照組(1.00±0.10)和anti-miR-NC組(0.96±0.09)低(P<0.05)。

2.2 抑制miR-26-5p對軟骨細胞增殖活力的影響MTT法檢測結果示，與對照組和anti-miR-NC組比較，anti-miR-26-5p組軟骨細胞在轉染48、72 h后增殖活力受到抑制(P<0.05)。見表1。

表1 抑制miR-26-5p對軟骨細胞增殖活力的影響

2.3 抑制miR-26-5p對軟骨細胞凋亡能力的影響流式細胞術檢測結果顯示，anti-miR-26-5p組軟骨細胞凋亡率(38.46±4.28)較對照組(10.26±1.61)和anti-miR-NC組(11.03±1.55)高(P<0.05)。對照組與anti-miR-NC組細胞凋亡率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.4 miR-26-5p靶向PTEN基因關系驗證生物信息學軟件預測結果顯示，miR-26-5p和PTEN3’UTR存在互補結合位點。見圖2A。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與PTEN-mut組相比，PTEN-wt組轉染miR-26-5p mimics的軟骨細胞的相對熒光素酶活性下降(P<0.05)。見圖2B。Western blot檢測PTEN蛋白表達水平發現，抑制miR-26-5p后軟骨細胞中PTEN蛋白表達量升高(P<0.05)。見圖2C。

A為生物信息學軟件預測miR-26-5p與PTEN存在堿基互補結合位點；B為雙熒光素酶報告基因實驗檢測相對熒光素酶活性，與PTEN-mut組比較，aP<0.05；C為Western blot檢測轉染miR-26-5p mimics對PTEN蛋白表達的影響，與對照組比較，aP<0.05，與anti-miR-NC組比較，bP<0.05。

3 討論

骨關節炎是一種慢性關節疾病，其特征是關節軟骨的退化和軟骨下骨和關節邊緣的骨再生。越來越多的證據表明，各種miRNA參與了骨關節炎的發生和發展。Wang等[6]揭示了骨關節炎患者和正常人的關節軟骨組織中miR-140-5p/149和FUT1的差異表達譜，且發現miR-140-5p/miR-149通過靶向調控FUT1調節軟骨細胞的凋亡和自噬，進而影響骨關節炎的發展。Wu等[7]研究發現miR-181可通過抑制PTEN的表達，抑制軟骨細胞增殖并誘導細胞凋亡。miR-26-5p屬于miR-26家族基因，其在多種腫瘤組織中異常表達，但關于其在骨關節炎中的研究目前仍較少。本實驗通過下調miR-26-5p的表達觀察對軟骨細胞增殖和凋亡的影響，結果發現下調miR-26-5p的表達后軟骨細胞增殖能力降低，凋亡率升高，表明抑制miR-26-5p可促進軟骨細胞凋亡，提示miR-26-5p在骨關節炎發生過程中發揮重要作用。這與Xie等[3]的研究相符，miR-26-5p在軟骨細胞中表達，miR-26-5p和NF-κB之間的相互抑制調節軟骨細胞中與肥胖相關的促炎細胞因子產生，肥胖與骨關節炎的發生和發展存在因果關系，表明miR-26-5p可能在骨關節炎的發生發展中起重要作用。

最近發現，PTEN參與骨關節炎的起始，PTEN在人骨關節炎軟骨和軟骨細胞中表達上調，并且與軟骨細胞反應和基質合成有關[8]。目前研究顯示，PTEN可能是miR-26-5p靶基因，表明其功能相關性。Yu等[9]報道顯示，miR-26a可通過調節PTEN的表達抑制HaCaT角質形成細胞的增殖和遷移。寧椿游等[10]研究發現，miR-26A可能通過直接抑制PTEN的表達來促進3T3-L1細胞的脂肪分化。為進一步了解miR-26-5p在骨關節炎發病和發展中的作用，本實驗通過TargetScan在線預測miR-26-5p的靶基因，預測結果發現PTEN3’UTR與miR-26-5p存在靶向結合位點，后續雙熒光素酶報告基因實驗驗證了PTEN是miR-26-5p的靶基因，隨后Western blot檢測結果發現了抑制miR-26-5p的表達可上調軟骨細胞中PTEN的表達，進一步驗證了miR-26-5p可靶向調控PTEN表達。本實驗結果提示miR-26-5p靶向PTEN影響軟骨細胞的增殖和凋亡，參與骨關節炎的發生。

綜上，在軟骨細胞中下調miR-26-5p可通過靶向PTEN基因抑制軟骨細胞增殖，促進細胞凋亡。本實驗只在單一細胞系中進行研究尚顯不足，后續將在多種細胞系及動物模型中進行驗證。隨著對miR-26-5p研究的深入，相信其可能對骨關節炎發病機制及骨關節炎的治療提供理論依據。