茶-山蒼子間作對茶園土壤微生物群落結構的影響

郝海平，白紅彤，夏菲，郝淵鵬，李慧，崔洪霞，謝曉明，石雷?

1中國科學院植物研究所/北方資源植物重點實驗室，北京100093；2廊坊師范學院生命科學學院，河北廊坊 065000；3江西虔心小鎮生態農業有限責任公司，中國科學院植物研究所虔心小鎮試驗基地，江西龍南 341708

0 引言

【研究意義】土壤微生物是茶園土壤生態系統的重要組成部分和最為活躍的生物因子，直接參與凋落物分解、養分循環及吸收等土壤生態過程，對茶樹的健康生長、茶葉品質，以及維持土壤生態系統功能穩定具有重要的影響[1-3]。芳香植物是茶園有害生物綜合治理（intergraded pest management，IPM）中重要的生物防治植物，是利用“Push-Pull”策略控制害蟲的典型間作材料，近年來，應用芳香植物間作模式進行茶園病蟲害生物防治逐漸普及[4]。因此，研究土壤微生物對茶-山蒼子間作模式的響應，辨別土壤微生物群落結構變化及其影響，對茶-芳香植物間作模式生態效應綜合評判和合理應用具有重要的理論和實踐意義?！厩叭搜芯窟M展】土壤微生物種群結構極其脆弱，受多種因素影響，如栽培模式、農藥和抗生素殘留、植物種類等[5-9]。朱慶松等[10]研究表明信陽毛尖茶園覆蓋稻草和白三葉顯著增加土壤微生物量、C、N和P含量。楊清平等[11]研究不同生態茶園土壤微生物數量與活性發現，松–茶–雞茶園土壤好氣性固氮菌、好氣性纖維素分解菌等比栗–茶生態茶園分別提高 2.8倍和1.6倍，比純茶園提高8.7倍和5.0倍。徐晨光等[12]研究表明添加100 mg·kg-1青霉素至茶園土壤中，茶園土壤細菌數量減少80%；王慧敏[13]研究表明，茶園間作芳香植物藿香、鼠尾草等提高了6月份和10月份的0—30 cm土層土壤微生物數量。CHEN等[14]研究同樣表明，果樹與芳香植物羅勒、薄荷間作，對于土壤氮循環細菌種群數量有顯著影響。芳香植物的顯著特點是合成和分泌大量的具有驅蟲和殺菌雙重功效的次生代謝產物。如山蒼子、迷迭香精油對茶葉害蟲茶假眼小綠葉蟬及致病菌金色葡萄球菌、枯草桿菌等均具有較強的驅避和抑制作用[15-17]?！颈狙芯壳腥朦c】盡管前人已經證明，間作芳香植物可以改變土壤微生物數量，但是土壤浸提液中具有殺菌和抑菌功能性成分如香茅醇、桉葉油醇與土壤微生物中致病、營養元素分解代謝等功能種群變化，以及土壤微生物種群結構改變與茶園土壤礦質營養元素相互關系方面還有待系統和深入研究?！緮M解決的關鍵問題】本研究以茶-山蒼子間作系統為基礎，圍繞土壤浸提液成分和土壤礦質營養元素，探討間作系統中土壤微生物群落結構變化規律及其影響因素。

1 材料與方法

1.1 試驗地點和材料

試驗地點位于江西省贛州市龍南縣臨塘鄉東坑村虔心小鎮生態茶園基地（114°78′ E，24°92′ N），海拔600 m，紅壤，pH 5.3。亞熱帶季風氣候區，年平均溫度18.9℃，年平均降雨量1 526.3 mm。

試驗地為竹林地開墾茶園，茶樹品種為‘白葉 1號’，與山蒼子間作時間約5年。試驗地為有機茶園，秋施基肥（雞糞、羊糞、豆餅肥）3 000—6 000 kg·hm-2，春茶后追施復合肥（N﹕P﹕K=15﹕15﹕15）150—225 kg·hm-2。茶葉每年分春茶和秋茶兩次采摘。2018年春茶采摘完成后對茶樹進行輕修剪，60 d后進行試驗采樣和數據測定。

本試驗的間作材料為山蒼子[Litsea cubeba (Lour.)Pers.]，是當地鄉土芳香植物，茶園偶有分布，多年觀測發現其對茶假眼小綠葉蟬具有顯著的驅避效應，是潛在的具有較高經濟價值和生物防治功能的茶園間作樹種。

1.2 試驗設計和取樣方法

間作試驗設計

處理組：以山蒼子樹干為圓心，以 0.5 m范圍內的茶樹和土壤為研究對象；對照組：選擇 500 m范圍內無山蒼子間作區域作為對照區。具體設計如表1：

表1 茶-山蒼子間作試驗設計表Table 1 List of controls and experimental treatments

1.3 試驗指標測定

土壤浸提液測定方法：采用乙酸乙酯浸提土壤，采用氣-質聯用（GC-MS）分析方法對其成分進行測定[18]。

取風干土樣2 000 g，分批置于有蓋玻璃瓶中，依次編號，按1:3體積比加入80%的乙酸乙酯溶液，將玻璃瓶放入振蕩培養箱，20℃，200 r/min，恒溫浸提24 h。按樣品編號依次完全轉入50 mL離心管中，5 000 r/min，離心15 min，過濾，取上清液，真空旋轉蒸發儀將上清液濃縮至 1—1.5 mL，濃縮條件溫度40—45℃，壓強300 hPa，濃縮液用無水硫酸脫水，轉移至安剖瓶保存，濃縮液即為土壤浸提液。

采用氣-質聯用（GC-MS）Agilent-6890 N/59731方法對浸提液進行分析，整體進樣，體積為1.0 μL。色譜條件：色譜柱為Agilent 122—3 832（30 m×0.25 mm×0.25 μm），色譜柱在70℃條件下，保持2 min，然后梯度升溫至 280℃，保持 20 min，升溫頻率 10℃·min-1，氣化室氣體為99.999%純度He氣，溫度為250℃，氣流量1.0 mL·min-1。質譜條件：EI源；電子能量70 eV，溫度230℃；掃描速度0. 2 s，掃描范圍（m/z）35—500 amu；溶劑延遲時間3.0 min。應用標準質譜譜庫對所得數據進行比對，浸提液各組分含量采用面積法進行計算。

微生物（細菌和真菌）多樣性測定方法：細菌采用16S rDNA，真菌采用ITS序列分析方法，由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成測定。

16S rDNA的PCR擴增：引物為515F 5′-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′和 907R 5′-GTGCCAGC MGCCGCGG-3′[15]。PCR 的 20 μL 混合反應體系包括4 μL 5×FastPfu Buffer，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，5 μmol·L-1的上、下游引物各 0.8 μL，0.4 μL FastPfu Polymerase，0.2 μL BSA和10 ng的樣本DNA。

ITS序列的PCR擴增：引物為ITS1F（5′-barcode-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和 ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）[15]。PCR 的 20 μL混合反應體系包括 4 μL的 10×Buffer，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，5 μmol·L-1上、下游引物各 0.8 μL，0.2 μL的rTaq Polymerase，10 ng的樣本DNA。

PCR反應儀器及參數：PCR儀：ABI GeneAmp?9700型。反應參數為： 95℃ 3 min；循環數×（95℃ 30 s；退火溫度 30 s；72℃ 45 s）；72℃ 10 min，10℃ until halted by user。

測序數據處理：將從Illumina MiSeq/HiSeq測序平臺得到的初始數據（Raw Data），根據Barcode序列拆分為不同樣品數據，并且截去PCR擴增引物序列和 Barcode序列。將拆分完成的數據應用 FLASH（V1.2.7，http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/）對每個樣品的reads進行拼接，拼接序列為原始Tags數據；將原始Tags從連續低質量值（默認質量閾值為≤3）堿基數達到設定長度（默認長度值為 3）的第一個低質量堿基位點截斷，然后進一步過濾掉其中連續高質量堿基長度小于Tags長度75%的Tags，然后與數據庫（Gold database，http://drive5.com/uchime/uchime_download.html）進行比對（UCHIME Algorithm，http://www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.ht ml）檢測嵌合體序列，去除嵌合體序列得到最終的有效數據。

OTU及物種群落分析：

（1）OTU聚類：應用Uparse軟件（Uparse v7.0.1001）對所有樣品的有效數據（effective tags）序列進行97%和95%的一致性聚類形成OTU；

（2）OTU注釋：選取OTU代表序列應用RDPClassifier方法，與GreenGene、RDP（16S）、Unite（ITS）數據庫進行比對獲得物種注釋信息；

（3）無效 OTU去除：去除嵌合體序列和測序錯誤序列；

（4）物種豐度統計：使用R軟件進行OTU各個分類等級的注釋比例和各個分類等級物種相對豐度的統計。

Alpha Diversity分析：稀釋曲線：將OTU數據進行抽平處理，使用QIIME軟件中的alpha_rarefaction.py程序進行稀釋曲線數據計算及構圖。

Beta Diversity指數統計：無度量多維標定法（nonmetric multidimensional scaling，NMDS），將OTU數據進行抽平處理，使用QIIME軟件計算beta多樣性距離矩陣，R語言vegan軟件包作NMDS分析和作圖。

微生物功能預測：基于上海美吉生物醫藥科技有限公司云平臺，細菌采用 Tax4Fun軟件；真菌采用FUNGuild軟件進行分析。

土壤礦質營養元素測定方法：稱取過60目篩風干土樣0.1 g，置于PTEE內膽中，順序加入氫氟酸1.5 mL，硝酸0.5 mL，扣合內膽，編號，置于配套鋼套內，150℃熱反應8 h，冷卻，取出內膽，150℃電熱板蒸發驅酸，剩余溶液約1 mL時，加入1 mL硝酸，1 mL雙蒸水，150℃回溶3 h，冷卻后轉移到40 mL聚乙烯瓶中，定容至40 mL，待測[19]。采用電感耦合等離子質譜（ICP-MS）儀測定 P、Mn、Cu、Zn、Fe、Mg離子含量。

1.4 數據分析

茶生長發育數據、微生物種群相對豐度、離子含量和土壤浸提液用 SPSS 16.0軟件進行 One-Way-ANOVA單因素方差分析；微生物和環境因子的冗余分析（RDA），采用Canoco 5軟件、Standard Analyses的Constrained程序進行，P＜0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 間作對茶園土壤微生物性質的影響

2.1.1 16S rDNA和ITS序列測序深度分析 山蒼子間作處理與對照細菌和真菌樣品稀釋曲線均趨于平緩，表明測序趨于飽和，測序數據量漸進合理，能夠相對真實地反映出土壤樣品中細菌和真菌的群落組成，取樣基本合理（圖1）。

2.1.2 土壤微生物的OTU數、Chao1和Shannon 指數變化 土壤細菌（圖 2-A、B、C），間作處理的OTU數、Chao1和Shannon指數顯著高于對照，差異顯著。CK.1和CK.2的OTU數分別為716、842；Lit.1和Lit.2分別為1 342、1 331，分別增加了87.4%和58.07%。Chao1和Shannon指數呈現與OTU數一致的變化規律，表明間作處理改變了土壤微生物種群和數量。

土壤真菌（圖2-D、E、F），OTU數、Chao1和Shannon指數變化規律與細菌類似，均表現為間作處理真菌種群評價指數顯著高于對照。CK.1和CK.2的OTU數分別為420、363，Lit.1和Lit.2分別為648、664，分別比對照增加了54.28%和82.92%。Chao1和Shannon指數變化趨勢與OTU數相似。

2.1.3 土壤微生物的NMDS分析 NMDS數據分析顯示，對照與山蒼子間作處理的微生物群落聚集于圖中不同區域，表明二者之間細菌、真菌種群類別存在顯著差異；對照和間作處理內不同土層深度細菌、真菌雖然豐度存在一定差異，但是種類基本一致（圖3）。

2.1.4 土壤微生物群落組成 山蒼子間作處理顯著改變了土壤細菌的群落組成。酸桿菌門、綠彎菌門、放線菌門群落結構變化顯著；變形菌門、芽單胞菌門、疣微菌門、GAL15、浮霉菌門、硝化螺旋菌門種群豐度變化較小。CK.1和CK.2的酸桿菌門種群豐度分別為16.45%、16.97%，Lit.1和Lit.2分別為33.08%、37.44%。放線菌門變化趨勢相反，Lit.1和Lit.2分別比CK.1和CK.2降低了54.76%和72.28%；綠彎菌門種群豐度分別降低了41.50%（Lit.1）、30.87%（Lit.2）（圖4）。

子囊菌門、接合菌門、擔子菌門、隱真菌門占整個菌群比例高，是主要真菌門類；其他真菌門類占整個菌群比例低，山蒼子間作出現了大量的未知真菌。間作處理顯著影響了子囊菌門和擔子菌門群落結構，Lit.2子囊菌門種群豐度為53.79%，CK.2為40.64%；山蒼子間作處理降低了擔子菌門種群豐度比例，Lit.1和Lit.2比CK.1和CK.2分別降低了81.86%和54.72%。在未鑒定真菌門類中，Lit.1和 Lit.2種群豐度分別為21.86%、17.95%，CK.1和CK.2分別為3.32%、9.82%（圖4）。

2.1.5 土壤微生物的潛在功能 針對豐度變化明顯的細菌種群進行功能分析，種群功能主要涉及植物病原菌，磷、錳營養元素代謝轉化，氮固定和代謝（表2）。山蒼子間作顯著影響了植物病原菌–黃單胞桿菌的豐度，CK.1和CK.2分別為218、493，Lit.1和Lit.2沒有檢測到黃單胞桿菌。具有溶解磷功能的伯克氏菌變化趨勢與黃單胞桿菌相反，Lit.1和 Lit.2的豐度分別比CK.1和CK.2增加62倍和86倍。具有錳氧化功能的土微菌變化趨勢與伯克氏菌相似，間作處理豐度比對照顯著升高（表2）。與氮固定代謝相關的真桿菌和棲熱菌豐度均呈現山蒼子間作處理高于對照的趨勢。如慢生根瘤菌Lit.1和Lit.2分別比CK.1和CK.2高146.09%和22.00%。

表2 微生物功能列表Table 2 List of microbe’s functions

子囊菌門真菌功能分析表明，豐度變化明顯的真菌主要涉及致病、生物防治和纖維素降解。山蒼子間作處理顯著降低了致病真菌鐮刀菌和山野殼菌的種群豐度（表 2）。CK.1和CK.2的豐度分別為4 729、3 122，Lit.1和 Lit.2為 695和 839，分別降低了 85.30%、73.13%；山野殼菌與鐮刀菌變化趨勢相似（表 2）。間作處理中，具有生物防治功能的擬康寧木霉種群豐度顯著增加，與CK.1相比，Lit.1的OTU數增加38.75倍，Lit.2比CK.2豐度增加239.37倍；毛殼菌變化趨勢與擬康寧木霉菌相似（表2）。

2.2 間作對茶園土壤浸提液影響

山蒼子間作區域土壤浸提液，共鑒定出苯乙烯、樟腦、Alpha-松油醇、香茅醇、鄰苯二甲酸二異丁酯、油酸酰胺等14種物質（表3）。峰面積占比大于5%的揮發物有6種，總占比為76.59%。6種揮發物中油酸酰胺峰面積占比最大，為28.57%；其次是樟腦和香茅醇，占比分別為12.80%和12.65%。Alpha-松油醇、鄰苯二甲酸二正丁酯峰面積占比 6%—7%。峰面積占比大于 2%的揮發物為苯乙烯、桉葉油醇、乙酸冰片酯、乙酸香茅酯、鄰苯二甲酸二異丁酯和棕櫚酰胺。山蒼子間作區域土壤浸提液含量最低的為2-甲基十七烷，占比為1.33%。

表3 山蒼子處理土壤提取物成分分析Tabble 3 Soil extract of Litsea cubeba intercropping treatment

2.3 間作對茶園土壤礦質營養元素影響

間作處理顯著影響土壤中的 P、Mn、Zn、Fe、Mg和Cu等元素含量。表層土壤中，CK.1的P元素含量 579.4 mg·kg-1，Lit.1 的含量為 932.8 mg·kg-1，間作處理比對照增加了 60.90%；根系分布層土壤中，Lit.2的P含量比CK.2增加了76.42%，差異顯著（圖5）。Mn元素的整體變化趨勢與P元素類似（圖5），Lit.1和Lit.2的Mn元素含量分別比CK.1和CK.2顯著增加198.74%和169.28%（P<0.05）；Zn、Cu、Fe、Mg元素呈現出與P和Mn類似的變化趨勢。

2.4 土壤微生物和環境因子冗余分析

土壤提取液和P元素位于第一和第四象限，表明二者與微生物群落結構變化呈正相關關系（圖 6、表 4），環境因子箭頭距原點距離較長，代表其與微生物群落變化間有較強的相關性。冗余分析結果顯示，土壤提取液是影響土壤微生物群落組成的主要環境因子，總體關聯度約 48%，差異顯著（P<0.05）；土壤提取液中的桉葉油醇（Ci）、Alpha-松油醇（Alp）、苯乙烯（Ph）、樟腦（Bo）和香茅醇是影響土壤微生物群落組成的主要成分（圖6、表4）。

土壤礦質營養元素中僅P元素對土壤微生物種群結構影響顯著（P<0.05）。Fe、Zn、Mg、Mn和 Cu元素對土壤微生物群落結構無顯著影響（圖6、表4）。

表4 土壤微生物和環境因子冗余分析Table 4 Redundancy analysis of soil microorganisms and environment factors

3 討論

土壤細菌和真菌是主要的土壤微生物類群，對土壤有機質分解、營養元素形態轉換以及土傳病害防治均具有重要作用。茶園優勢的細菌門類有酸桿菌門、綠彎菌門、放線菌門、變形菌門、浮霉菌門；真菌門類有子囊菌門、接合菌門、擔子菌門、隱真菌門，間作沒有顯著改變茶園土壤微生物優勢門類（圖 4），這與前人研究結果相似[20]。但是，茶-山蒼子間作增加了土壤微生物群落總數，豐富了群落多樣性，間作土壤中細菌和真菌的OTU數、Chao1和Shannon指數均顯著高于對照（圖 2），變化較大的門類是酸桿菌門和子囊菌門（圖4）。楊清平等[11]研究發現栗–茶生態茶園土壤微生物數量、活性顯著高于純茶園；茶園間作芳香植物藿香、鼠尾草0—30 cm土層土壤微生物數量顯著高于純茶園[13]。間作改變茶園土壤微生物群落結構和豐度可能與土壤營養改善，茶園的植物種類增加，凋落物和根系分泌物增多有關。山蒼子間作處理顯著影響土壤 Mn、Cu、Fe等礦質營養元素，尤其間作處理的土壤磷元素比對照升高60.9%（圖5），具有溶解磷、錳氧化和氮元素循環功能細菌，如 Lit.1中固氮菌比CK.1增加了146.09%（表2）。也有研究[21-22]發現茶園紅壤的 CY06系列菌株影響土壤磷的溶解性。土壤增施N、P和K營養，土壤微生物種群豐度顯著提高[23-26]。因此，土壤中營養元素含量增加，尤其是 P，可能跟土壤微生物種群結構改變和豐度增加有關。冗余分析印證了這一推斷，土壤礦質營養元素P、Fe、Mn、Zn等與土壤微生物群落豐度具有一定的相關性，尤其是 P，達到顯著相關。磷是間作改變土壤微生物群結構的主要土壤營養因子。

茶園間作，植物凋落物分解與根系分泌所產生的次生代謝產物，也顯著影響土壤微生物的群落組成，影響方式和強度因植物而異。高寒草甸、煙草、葡萄等植物研究發現，不同植物類群覆蓋下的土壤微生物種群結構和豐度因植物根系分泌物不同而差異顯著[27-30]。本研究觀測到山蒼子間作處理的植物病原真菌鐮刀菌、山野殼菌和植物病原細菌黃單胞桿菌種群豐度顯著降低，如表土層和根系分布層的鐮刀菌，山蒼子間作處理種群豐度與對照相比分別降低了 85.3%和73.13%，而具有苯降解功能的黃色菌種群豐度則顯著增加。這可能跟山蒼子次生代謝類物質進入土壤有關。茶-山蒼子間作區域土壤浸提液中樟腦、Alpha-松油醇和香茅醇具有抑菌和殺菌功能，酰胺類物質、鄰苯類物質占比也較大（表 3）。前人研究已經證明香茅醇對茶莖點霉屬病原菌具有擬制和殺滅作用[31-32]；Alpha-松油醇對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和大腸桿菌等具有一定的殺滅和抑制作用[33]。因此，土壤中植物病原微生物可能因樟腦、香茅醇等殺菌物質存在而減少，苯降解功能菌與含苯環類物質含量高相關。冗余分析顯示，土壤浸提液即山蒼子通過淋溶、分解或根系分泌進入土壤的次生代謝產物如Alpha-松油醇、香茅醇、樟腦、桉葉油醇等顯著影響土壤微生物群落結構和豐度。茶-山蒼子間作，土壤浸提液中的殺菌成分是間作影響土壤微生物群落結構的重要生態因子。

4 結論

茶-山蒼子間作改變了土壤微生物群落結構和豐度，增加了土壤礦質營養轉化吸收的功能性種群，降低了植物致病真菌和細菌數量，樟腦、Alpha-松油醇和香茅醇等次生代謝產物和P元素是土壤微生物群落變化的主要環境因子。茶園及其他農田系統間作植物的選擇應重視間作植物次生代謝產物的輸入，尤其是其中具有殺滅或抑菌功能的成分。