紫花苜蓿MsMAX2的克隆及功能研究

馬琳，溫紅雨，王學敏，高洪文，龐永珍

紫花苜蓿的克隆及功能研究

馬琳，溫紅雨，王學敏，高洪文，龐永珍

中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193

分枝是重要的產量構成因子，在紫花苜蓿育種中至關重要。發掘紫花苜蓿分枝相關基因并明確其作用機理，有助于加快紫花苜蓿高產優質育種。是重要的分枝相關基因，參與多種植物的分枝調控。【】通過對紫花苜蓿功能的研究，為建立調控紫花苜蓿分枝發育分子機制奠定基礎。利用同源克隆的方法從紫花苜蓿中獲得的基因序列。通過Expy Protparatam、DNAMAN和MEGA-X等軟件對進行序列分析并構建系統進化樹。采用實時熒光定量PCR（qPCR）方法分析在紫花苜蓿中的組織表達特異性。運用煙草瞬時表達系統確定MsMAX2蛋白的亞細胞定位。利用農桿菌介導的轉化方法獲得轉基因擬南芥，以明確的基因功能。用酵母雙雜交技術探明與MsMAX2互作的蛋白。包含長度為2 136 bp的開放閱讀框，編碼由711個氨基酸構成的蛋白，屬于F-box蛋白超家族。系統進化分析表明，及其同源基因的進化與物種的分化高度相似，表明其是一個功能保守的基因。在紫花苜蓿的頸部組織中表達量最高，苗期葉片和授粉當天的花序中表達量較高，根中次之，其他組織表達量相對較低，暗示其在紫花苜蓿多個組織中發揮作用。亞細胞定位試驗表明MsMAX2蛋白定位于細胞核中。在擬南芥突變體中過表達可互補突變體的多分枝表型。酵母雙雜交試驗表明MsMAX2與激素受體D14存在依賴于獨腳金內酯的相互作用。獲得在紫花苜蓿頸部組織中高水平表達的，其編碼的蛋白定位于細胞核中；在擬南芥多分枝突變體中過表達時，能夠互補突變表型，表明參與植物的分枝調控，其功能保守。

紫花苜蓿；；分枝；互補試驗；酵母雙雜交

0 引言

【研究意義】紫花苜蓿（L.）是優質的多年生豆科牧草，在現代畜牧業發展中具有舉足輕重的地位[1-2]。近5年來（2016—2020年），中國紫花苜蓿干草年平均進口量為137.647萬t，進口金額達4.5213億美元（數據來源：中國海關http:// online.customs.gov.cn/）。加快提高紫花苜蓿產量對于減少對進口飼草的依賴，促進中國畜牧業發展具有重要意義[3]。分枝是紫花苜蓿重要的產量構成因子，較多的分枝往往代表著較高的牧草產量和品質[4-5]。因此，發掘紫花苜蓿分枝發育相關基因，明確其作用機理，對培育高產優質的紫花苜蓿至關重要。【前人研究進展】植物的分枝起源于頂端分生組織和側生分生組織，其大致可分為2個過程，即葉腋分生組織的形成和腋芽的生長發育；處于休眠狀態的腋芽能否活化進而生長是植物能否形成分枝的關鍵因素[6]。研究表明，腋芽的活化生長是生長素（auxin，IAA）、細胞分裂素（cytokinin，CK）、獨腳金內酯及其衍生物（strigolactones，SLs）協同作用的結果[7-8]。而F-box蛋白MAX2/D3/RSM4在腋芽的活化生長中發揮重要作用[9-11]。首次在擬南芥中被報道，其突變體表現為分枝多而密，對獨腳金內酯不敏感[12]。進一步對參與SLs調控分枝發育的研究表明，當SLs存在時，受體D14結合并水解SLs，進一步發生構象變化形成SCFMAX2-D14-D53復合體，促使D53/SMXL6-8等轉錄抑制因子進入26S蛋白酶體降解途徑，解除對分枝調控基因、及（）等因子的抑制，從而激活下游分枝發育基因的表達[13-16]。此外，近年來，研究表明同樣參與根及根毛的發育[17]、葉片衰老[18]、種子萌發[19]、下胚軸伸長[20]、生物和非生物脅迫[21-22]以及光形態建成[23]等生物學過程，進一步表明在植物生長發育中具有關鍵作用。【本研究切入點】雖然目前已在模式植物中建立了調控分枝發育的分子模型[15-16]。但是是否調控紫花苜蓿的分枝發育及其調控機理尚不明確。【擬解決的關鍵問題】本研究克隆了紫花苜蓿的，明確該基因在紫花苜蓿中的組織表達特異性，確定MsMAX2蛋白的亞細胞定位；在擬南芥突變體中過表達，闡明該基因的功能；此外，利用酵母雙雜交明確的作用機制，為深入研究調控紫花苜蓿分枝發育的機理奠定基礎，同時也為紫花苜蓿高產優質育種提供優異的基因資源和材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料為紫花苜蓿品種中苜1號以及本氏煙草，載體為植物表達載體pBI121△GUS及亞細胞定位載體pCAMBIA1300，菌株為大腸桿菌菌株DH5α、農桿菌菌株GV3101以及酵母菌株AH109，以上試驗材料均由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所保存。擬南芥突變體購于AraShare平臺。試驗引物由北京六合華大合成（電子附表1）。

1.2 DNA、RNA提取及cDNA合成

使用改良CTAB法提取紫花苜蓿的DNA，經Nanodrop檢測質量后，稀釋至50 ng·μL-1備用。收集紫花苜蓿苗期、分枝期、開花期、莢果期的13個不同組織，使用Eastep? Super Total RNA Extraction Kit試劑盒（上海普洛麥格生物科技有限公司）提取總RNA。使用TransScript Green One-Step qRT-PCR mix（北京全式金生物科技有限公司）將4 μg的總RNA反轉錄為cDNA，稀釋8倍后備用。

1.3 PCR及實時熒光定量PCR（qPCR）

試驗涉及2種PCR體系，一種為50 μL PCR體系，包含100—200 ng DNA、5 μL PCR buffer、5 μL dNTPs、2.5 μL Mg2+、3 μL引物以及1.5 μL KOD plus酶（北京百靈克生物技術有限公司）；另一種為20 μL PCR體系，包含50—100 ng DNA、10 μL 2×Taq PCR mix（北京天根生化科技有限公司）以及1 μL引物。PCR程序為94℃180 s；94℃30 s，57℃30 s，72℃90 s，共35個循環；72℃300 s。

實時熒光定量PCR體系為20 μL，包含20—50 ng模板、10 μL qPCR mix（北京康潤生物科技有限公司）以及1 μL引物。采用兩步法，使用ABI7500 Real-Time PCR system（美國ABI公司）進行擴增。qPCR程序為94℃60 s；94℃34 s，60℃ 34 s，共45個循環。

1.4 基因克隆及序列分析

以紫花苜蓿13個組織（苗期的葉片、根、頸部、枝、頂部；分枝期的莖、葉片、頂部；開花期的莖、葉片、花序；授粉當天的花序；授粉5 d的果莢）混合的cDNA為模板，使用KOD plus酶，引物MsMAX2-F/R進行擴增，產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測、純化后連接入pEASY-Blunt克隆載體并轉入大腸桿菌菌株DH5α，挑取陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

利用Expy Protparatam（https://web.expasy.org/ protparam/）在線軟件分析的開放閱讀框及編碼蛋白的氨基酸序列，同時分析MsMAX2蛋白的理化性質。使用DNAMAN對的同源基因進行多序列比對，用MEGA-X軟件選擇最大似然法（maximum likelihood，ML）法構建系統發育樹，Bootstrap 值設定為1 000。

1.5 載體構建及農桿菌轉化

構建植物過表達載體pBI121△GUS::用于轉化擬南芥，具體步驟為：使用限制性內切酶Ⅰ及Ⅰ線性化載體pBI121△GUS并純化；利用引物pBI121MsMAX2-F/R擴增獲得的編碼區。使用無縫克隆試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）連接線性化的載體及，經測序驗證后獲得重組的植物過表達載體。

構建帶有GFP標簽的瞬時表達載體pCAMBIA1300::用于亞細胞定位分析，具體步驟為：使用限制性內切酶HⅠ和Ⅰ線性化載體pCAMBIA1300并純化；利用引物p1300MsMAX2-F/R擴增獲得編碼區。使用無縫克隆試劑盒連接和線性化載體，經測序驗證獲得重組的瞬時表達載體。

將以上2個重組載體利用凍融法轉入農桿菌菌株GV3101，并分別用于擬南芥和煙草轉化。

1.6 轉基因陽性擬南芥植株的獲得

利用花序浸染法轉化擬南芥，具體步驟為：挑取包含重組載體pBI121△GUS::的陽性農桿菌菌落至100 ml LB液體培養基（50 mg·L-1卡那霉素，25 mg·L-1利福平）中，28℃，220 r/min培養20 h至OD600=0.8，重懸菌體于等體積的5%的蔗糖溶液中，加入0.02%的表面活性劑，浸染擬南芥花序；浸染后的擬南芥正常生長至收獲種子（T0代）。在MS固體培養基（25 mg·L-1卡那霉素）上篩選收獲的種子最終獲得T3代純合種子用于表型分析。

1.7 亞細胞定位

挑取包含重組載體pCAMBIA1300::的陽性農桿菌菌落至LB液體培養基（含50 mg·L-1卡那霉素，25 mg·L-1利福平）中培養，28℃，250 r/min培養14 h至OD600=0.8；4 000 r/min離心10 min后收集菌體，重懸于等體積的乙酰丁香酮溶液中，靜置3 h后注射至長勢一致的本氏煙草葉片中。注射后的煙草于溫室中培養2 d，使用LEICA TCS SP8共聚焦顯微鏡觀察侵染的葉片，確定MsMAX2蛋白的亞細胞定位。

1.8 酵母雙雜交試驗

構建包含結合結構域（binding domain，BD）的載體pGBDKT7::及包含激活結構域（activatingdomain，AD）的載體pGADT7::，pGADT7::酵母重組質粒。共轉pGBDKT7::和pGADT7::，pGBDKT7::和pGADT7::以及pGBDKT7::和pGADT7::至酵母菌株AH109感受態中，涂布于SD/-Trp/-Leu二缺平板上進行篩選。挑取陽性轉化子至SD/-Trp/ -Leu/-His/-Ade平板上，觀察酵母生長狀態，確定蛋白之間的兩兩互作關系。

1.9 數據分析

使用Microsoft Excel 2010和SPSS11.5軟件對試驗數據進行整理和統計分析。

2 結果

2.1 紫花苜蓿MsMAX2的克隆與序列分析

分別以紫花苜蓿品種中苜1號的混合cDNA（1.4部分所述的13個組織）和DNA為模板，引物MsMAX2-F/ MsMAX2-R進行PCR擴增，均獲得長度為2 500 bp左右的條帶。將產物純化、連接克隆載體并測序，獲得紫花苜蓿的cDNA和基因序列。比對發現該基因僅包含一個外顯子，其CDS長度為2 136 bp；編碼蛋白711 aa，分子量為80.01 kD，等電點為5.61，不穩定系數為42.69，屬于不穩定蛋白，親水性系數為-0.187，屬于疏水性蛋白。

利用DNAMAN將MsMAX2與其他植物中的同源蛋白進行多重序列比對和保守結構域預測，發現MAX2同源蛋白含有典型的F-box保守結構域（PF11234），屬于F-box蛋白超家族，同時還包含典型的Leucine-rice repeat（LRR）結構域（圖1）。利用MEGA構建系統進化樹進一步明確MsMAX2在物種中的進化位置和親緣關系。結果表明，植物中MAX2蛋白的進化關系和物種的親緣關系一致，即單子葉植物中的MAX2蛋白聚為一類，雙子葉植物中的MAX2蛋白聚為另一類。與MsMAX2親緣關系最近的是蒺藜苜蓿中的同源蛋白，親緣關系最遠的雙子葉植物是擬南芥（圖2）。

橙色框與黑色線標出的分別為F-box結構域和LRR重復the F-box domain (in orange frame) and leucine-rich repeat (in black lines)

2.2 MsMAX2的組織表達特異性

采用qPCR研究在紫花苜蓿苗期、分枝期、開花期、莢果期的根、頸部、莖、葉、花序、莢果等13個組織中相對表達量（圖3）。結果表明，在紫花苜蓿的不同組織中均有表達，但其相對表達豐度卻具有組織特異性。在頸部的表達量最高，苗期葉片、授粉當天的花序次之，其次是苗期的其他組織；相對表達量最低的組織是莖，次之是葉片。在紫花苜蓿頸部的高豐度表達與該基因參與分枝發育密切相關；而在其他組織中的表達則暗示功能的多樣性，參與紫花苜蓿的多個生長發育過程。

2.3 MsMAX2蛋白的亞細胞定位

利用煙草瞬時表達系統研究了MsMAX2蛋白的亞細胞定位（圖4），結果表明，在包含空載體pCAMBIA1300的煙草表皮細胞中，其綠色熒光信號分布于細胞膜、細胞核和細胞質中（圖4-A—圖4-D）。而包含重組載體pCAMBIA1300::的煙草細胞，其綠色熒光信號則僅分布于細胞核中（圖4-E—圖4-H），表明MsMAX2定位于細胞核中。

2.4 MsMAX2互補擬南芥max2突變體的表型

擬南芥的缺失突變體表現為初級分枝和次級分枝增多（圖5-A）。利用qPCR檢測轉基因陽性擬南芥中的表達量，結果表明，轉基因植株中的表達量顯著高于野生型，而內源的表達水平則與背景植株相似（圖5-B）。對野生型擬南芥（WT）、突變體以及過表達植株進行分枝表型的觀察比較，發現與WT相比，突變體的初級分枝和次級分枝顯著增多，而在背景下過表達使得其分枝增多的表型丟失，初級分枝和次級分枝的數量與野生型相比沒有顯著性差異，即可以互補擬南芥的突變表型（圖5-C）。

AtMAX2：擬南芥，NP_565979.1；GmMAX2：大豆，XP_003540983.1；RMS4：豌豆，ABD67495.1；CaMAX2：鷹嘴豆，XP_004505491.1；TpMAX2：紅三葉，PNX93440.1；MtMAX2：蒺藜苜蓿，XP_003607592.1；OsD3：水稻，NP_001174608.1；BdMAX2：短柄草，XP_003564315.1；TaMAX2：小麥，AZS54115.1；ZmMAX2：玉米，AQL02030.1；SbMAX2：高粱，XP_002436499.1；SiMAX2：谷子，XP_004964817.1。紅色陰影為雙子葉植物，藍色陰影為單子葉植物

2.5 MsMAX2與AtD14、AtSMXL7的相互作用

為了明確互補擬南芥突變體表型的作用機理，進而研究在紫花苜蓿分枝調控中的作用機制，利用酵母雙雜交驗證與、的相互作用關系。結果顯示，含有pGBDKT7::和pGADT7::重組質粒的酵母菌株能夠在添加GR24（一種SLs的人工合成替代品）的缺陷培養基上生長，但不能在未添加GR24的缺陷培養基上生長；而含有pGBDKT7::和pGADT7::重組質粒的酵母菌株在2種培養基上均不能生長（圖6）。以上結果表明，MsMAX2與AtD14的相互作用依賴于獨腳金內酯激素的存在，而MsMAX2與AtSMXL7之間則不存在相互作用。這一結果表明MsMAX2與其他模式物種中的MAX2類似，也是通過參與獨腳金內酯激素介導的分枝調控參與植物的分枝發育。

圖4 MsMAX2蛋白在煙草表皮細胞中的亞細胞定位

野生型、max2及max2背景下過表達MsMAX2擬南芥植株的表型（A）、基因表達量（B）和分枝數（C）

GR24是SLs的人工合成替代品 GR24 is a synthetic substitute of SLs

3 討論

3.1 MAX2參與調控植物的分枝發育

參與多種生物學過程，其中調控分枝發育的功能被研究得較為深入。的突變導致擬南芥（）、水稻（）和豌豆（）的突變體分枝增多[9-10,24]。目前，已在擬南芥、水稻和豌豆中建立了調控分枝發育的分子模型，而是否參與紫花苜蓿的分枝發育調控尚不明確。

本研究通過對紫花苜蓿系統發育分析發現在物種中的進化與物種的分化高度相似（圖1和圖2），表明其是一個功能較為保守的基因[25]，這為后續的功能研究奠定基礎。組織表達特異性分析發現在紫花苜蓿的頸部高豐度表達，這與該基因參與分枝發育密切相關；通過在擬南芥突變體中過表達，發現能夠互補擬南芥突變體的多分枝表型（圖5），表明在調控植物分枝發育中的保守性。

在調控分枝發育的分子模型中，SLs受體D14同時具有結合SLs和水解SLs的作用，發生構象變化的D14一方面結合可以SCFMAX2復合體，另一方面可以招募D53、SMXL6、SMXL7和SMXL8等蛋白進入26S蛋白酶體降解。這些蛋白結合了等轉錄因子，它們的降解直接釋放了以上轉錄因子，促進下游抑制分枝基因的表達[13-18]。同時，D14對SLs的降解使得SLs信號中斷，平衡分枝的發育[13]。進一步的研究還表明，通過參與SLs信號轉導而非合成途徑參與植物的分枝發育[26]。本研究利用酵母雙雜交技術，證實了MsMAX2與AtD14同樣存在SLs依賴的相互作用，而MsMAX2則不存在與AtSMXL7的相互作用，推測在紫花苜蓿中同樣存在保守的調控機制（圖6）。后續可進一步對在紫花苜蓿中進行基因沉默或編輯，并利用RNA-seq等手段檢測沉默/編輯植株中差異表達的基因，進而明確調控紫花苜蓿分枝發育的分子機制。

3.2 MsMAX2在紫花苜蓿育種中的應用潛力

紫花苜蓿是優良的豆科牧草，近年來，隨著中國畜牧業的發展，國內對于優質高產的紫花苜蓿品種需求量越來越大。而目前國內紫花苜蓿育種多采用群體育種、雜交育種等傳統育種方式，育種周期長，品種更新換代速度慢[27-28]。紫花苜蓿作為典型的同源四倍體物種，又具有自交衰退的不足，這些特征導致了紫花苜蓿功能基因組學研究滯后，分子設計育種進程遠遠滯后于其他重要作物[29-30]。

然而，隨著紫花苜蓿基因組的公布，紫花苜蓿分子設計育種進入了新的紀元[31-32]。利用基因編輯的手段對某個特定的功能基因進行編輯，進而創制紫花苜蓿新種質，將會有針對性地對某一特定性狀進行改良，進而加快紫花苜蓿的育種進程。因此，對于紫花苜蓿功能基因的研究勢必會越來越深入，而建立紫花苜蓿中基因功能的分子模型/分子機制也同樣重要。

本研究根據同源基因功能的保守性推測分枝相關基因在紫花苜蓿中同樣可以調控分枝發育，該基因可以互補擬南芥多分枝突變體的試驗也初步證實了這一猜想（圖5）。在單子葉模式植物水稻中也發現了與雙子葉植物擬南芥類似的現象，即同源基因（）的沉默也產生了分蘗增多的表型[10]。同樣地，在另一個與紫花苜蓿同屬豆科的模式植物豌豆中，同源基因（）的沉默也產生了多分枝，生物量增大的表型[25]。根據這些模式植物中的相關結果，可以推測紫花苜蓿中的沉默也將產生分枝增多的表型。如將這一策略運用在紫花苜蓿中，即對該基因進行定向基因編輯，產生分枝顯著增多的表型，創制該基因編輯后的新材料，可以為紫花苜蓿高產優質育種提供優異的種質資源，在紫花苜蓿分子育種中具有巨大的潛力。

4 結論

利用同源克隆的方法獲得紫花苜蓿，該基因高豐度地表達于紫花苜蓿的頸部組織中，其編碼蛋白定位于細胞核中；在擬南芥多分枝突變體中過表達，能夠互補其分枝增多的突變表型，表明保守地參與植物的分枝調控。

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Cloning and Function Analysis ofgene in alfalfa (L.)

MA Lin, WEN HongYu, WANG XueMin, GAO HongWen, PANG YongZhen

Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193

【】Branching is one of the key yield components, which plays an important role in alfalfa (L.) breeding. Exploring and functional characterization of key branching-related genes are of significance in accelerating breeding of alfalfa with high yield and quality.is an important branching-related gene, which is involved in the regulation of branching in several plant species. 【】Our research on the functional characterization ofregulating branch development in alfalfa. 【】The gene sequence ofwere analyzed by using bioinformatics tools including Expy Protparatam, DNAMAN, and MEGA-X. The real-time quantitative PCR (qPCR) was applied to detect the tissue-specific expression pattern ofThe subcellular localization of the MsMAX2 protein was determined by using transient expression system in tobacco. The biological function ofwas clarified by transformation in themutant-mediated transformation. Proteins interacting with MsMAX2 were determined by using yeast two-hybrid assay. 【】The length ofCDS is 2 136 bp, encoding a protein of 711 amino acids, and it belongs to the F-box protein super-family. Phylogenetic analysis showed that the evolution ofhomologs was highly similar to the differentiation of species, indicating thatwas a functionally conserved gene.It was showed thatwas expressed in the neck at the highest level, followed by in the leaves of seedling, the inflorescences on pollination day and the roots; the expression level ofwas relatively low in other tissues, indicating it functions in multiple tissues. Subcellular localization assay showed that the MsMAX2 protein was localized in the nucleus. Complementation assay inmutant showed that the multi-branch phenotype was recovered by the ectopic expression of. Yeast two hybrid assay demonstrated that the interaction between MsMAX2 and hormone receptor D14 depended on the existence of strigolactones. 【】Thewas obtained from alfalfa and it was highly expressed in the neck and the encodingMsMAX2 protein was localized in nucleus. When thewasover-expressed in themutant, its multi-branch phenotype was recovered, indicating thatregulates branch development in alfalfa plant, and its function was conserved.

alfalfa;; branching; complementation assay; yeast two hybrid assay

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.19.003

2021-03-05；

2021-04-19

國家自然科學基金（31802118）、中國農業科學院科技創新工程（ASTIP-IAS10）

馬琳，E-mail：malin@caas.cn。通信作者龐永珍，E-mail：pangyongzhen@caas.cn

（責任編輯 李莉）