理中湯加味對大鼠復發性口腔潰瘍黏膜的修復作用及對NF-κB炎癥通路的影響

高峻鷹 李慶隆 耿乾書

復發性口腔潰瘍(recurrent oral ulcer，ROU)，又稱為復發性阿弗他性口炎，是口腔潰瘍性疾病的常見形式，最常見形式，影響著全球多達5%～20%的人口，其特點是該病可在口腔黏膜的任何位置出現一個或多個圓形或橢圓形的潰瘍，具有良性和自限性的特點，但經常復發，伴有明顯的疼痛，常導致患者口腔功能障礙[1-2]。ROU的治療包括含漱劑、含片、散劑、局部封閉等局部治療方法，以及免疫抑制劑、免疫調節劑和增強劑等全身治療方法，但在治療期間患者依從性較差，整體治療效果不佳[3]。近年來，中醫藥在臨床廣泛使用，對ROU的治療表現出明顯優勢，可預防患者口腔潰瘍遠期發作[4]。中醫理論認為，口腔潰瘍與正氣虧虛、脾胃虛寒有關[5]。理中湯具有補氣健脾、溫中祛寒之功效，已有多項研究報道，理中湯及其加味方對ROU疾病具有較好的治療效果，能夠使潰瘍面積縮小，疼痛減輕，胃脘疼痛、反酸燒心等其他伴有癥狀亦得到明顯改善，但其作用機制尚不清晰[6～7]。長期以來，NF-κB信號通路被認為是經典的促炎信號轉導途徑，IκB在IKK的激活作用下被磷酸化，磷酸化的IκB被進一步泛素化而被蛋白酶降解，釋放出NF-κB二聚體并進入細胞核，NF-κB信號通路被激活后，可增加TNF-α等基因的轉錄，進而增加炎癥因子的釋放，激活機體的炎癥反應并使其擴大化和持續化[8～9]。免疫法ROU模型，即通過弗氏佐劑和口腔黏膜組織均漿建立的大鼠ROU模型，從癥狀表現和病理學檢查方面均與人類ROU的發作相似，可從造模后第3周至第8周內持續出現多個潰瘍病灶，目前已被廣泛用于口腔潰瘍實驗研究中[10～11]。本研究通過免疫法建立大鼠ROU模型探討理中湯加味對大鼠ROU的修復作用及其對NF-κB炎癥通路的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

72 只6 周齡Wistar大鼠(180～220 g)，雌雄各半(北京維通利華實驗動物技術有限公司)。許可證號：SCXK(京)2017-0011。飼養條件：室溫(22±2)℃，濕度(50±10)%，每天定時換氣，保持12 h：12 h光暗照明，食水不限。

1.2 藥品與試劑

理中湯加味方(黨參、黃芪、茯苓各20 g，白術、干姜各15 g，炮附子、五味子、山藥各10 g，炙甘草5 g，康美藥業股份有限公司)；醋酸潑尼松龍注射液(浙江仙琚制藥股份有限公司)；完全弗氏佐劑(Sigma-Aldrich,美國)；ELISA試劑盒(武漢Elabscience公司)；實驗所需兔單抗及羊抗兔二抗(CST公司，美國)；蘇木精和伊紅染色液、ECL發光液(北京Solarbio公司)。

1.3 方法

1.3.1 分組與造模 隨機選取12 只大鼠，于無菌環境下在其口腔黏膜處注射生理鹽水，剝離口腔黏膜，放置于組織研磨器中，加入0.1 mol/L，pH=7.4的PBS緩沖液研磨成勻漿，再加入等量的完全弗氏佐劑，混合均勻直至呈無分層的乳狀液，即為組織乳化劑。將剩余的60 只大鼠按照隨機數字表法分為正常組、模型組、陽性對照組及理中湯高劑量、中劑量和低劑量組，除正常組之外的其余組大鼠均采用免疫法建立ROU模型，具體方法：將各組大鼠脊柱兩側脫毛備皮，消毒，在脊柱兩側分別皮內注射0.1 mL組織乳化劑，每周1次，連續8周，正常組大鼠采用同樣的方法在相同位置注射等體積的生理鹽水[11]。8 周后，觀察各組大鼠口腔潰瘍形成情況，模型組、陽性對照組、理中湯高劑量、理中湯中劑量和理中湯低劑量組大鼠均成功建立ROU模型，存活大鼠的數量分別為：8 只、9 只、9 只、9 只、8 只。大鼠的唇黏膜、頰黏膜以及口底部呈現多個呈橢圓或圓形的潰瘍面，表面有灰黃色假膜，邊緣整齊，直徑1～2 mm。

1.3.2 藥液制備 取理中湯加味方諸藥，用蒸餾水浸泡12 h，其中炮附子先煎煮1 h，再加入其余藥材煎煮40 min，共重復3 次，將所有藥液濃縮至4 g/mL(即每毫升含生藥量為4 g)，分裝后儲存于4 ℃冰箱備用。

1.3.3 給藥方法 從第9周開始，陽性對照組大鼠灌胃給予20 mL/kg的醋酸潑尼松龍注射液(1 mg/mL)，理中湯高劑量組、中劑量組和低劑量組大鼠分別給予40、20、10 g/kg的理中湯加味方藥液，給藥體積為1 mL/100 g，正常組和模型組大鼠灌胃給予相同劑量生理鹽水，1 次/d，連續20 d。

1.3.4 理中湯加味對大鼠口腔潰瘍數量、持續和間隔時間的影響 觀察并記錄大鼠口腔潰瘍數量、持續和間隔時間，測量給藥前一天及給藥后5、10、15、20 d時大鼠口腔潰瘍面積，取平均值。潰瘍面積(mm2)=π×d1×d2×1/4，π取值3.14，d1和d2分別為口腔潰瘍的最大橫徑和最大縱徑。

1.3.5 ELISA試劑盒檢測理中湯加味對大鼠血清中炎癥因子水平的影響 最后一次給藥后2 h后，麻醉大鼠，通過腹主動脈穿刺取血，分離出血清用于ELISA試劑盒檢測，根據試劑盒說明書制作出標準曲線，檢測并計算血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

1.3.6 HE染色觀察口腔黏膜病變 1.3.5的實驗結束后，分離各組動物口腔潰瘍區域的組織，分割成適宜大小的組織塊后固定48 h，制作石蠟組織標本和病理切片(將石蠟組織塊置于切片機上制成厚度為4 μm的組織切片)，然后行常規HE染色，封片后于光鏡下觀察口腔黏膜病變。

1.3.7 Western blot檢測潰瘍組織NF-κB炎癥通路蛋白表達 取口腔黏膜組織，稱重，剪碎，加入細胞裂解液研磨勻漿并離心，提取組織蛋白，并用BCA法確定濃度，按照20 μg/孔的蛋白量常規上樣、電泳、轉膜、封閉，把轉印后的PVDF膜加入一抗溶液(1∶2 000)中4 ℃孵育過夜，次日洗膜，放入二抗溶液(1∶2 000)中在37 ℃恒溫箱中孵育2 h，再次清洗后滴加適量發光試劑，放入凝膠成像儀中顯影。Image J軟件用于獲取目標蛋白的灰度值并進行統計分析。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠口腔潰瘍的改善情況

截止到取材當天，除正常組大鼠未出現口腔潰瘍之外，其余組均出現口腔潰瘍，潰瘍面不規則，表面覆有白色假膜，周圍黏膜有紅腫、充血。陽性對照組、理中湯高劑量組、中劑量組和低劑量組大鼠口腔潰瘍得到一定程度改善，潰瘍面縮小，陽性對照藥物和理中湯高劑量的治療效果優于理中湯中劑量和低劑量組(圖 1)。HE染色結果顯示，正常組大鼠口腔黏膜角化層、顆粒層、棘層和基底層結構完整，可見少量淋巴細胞和紅細胞外滲。模型組大鼠口腔黏膜上皮層細胞脫落，棘層松散，炎性細胞浸潤明顯，亦可見紅細胞外滲現象。與模型組比較，其余各組大鼠口腔黏膜組織的炎癥浸潤程度均減輕，黏膜組織結構清晰、完整，這種作用在陽性對照組和理中湯高劑量組中更加顯著(圖 2)。在潰瘍數量、潰瘍持續和間隔時間方面，與模型組比較，陽性對照組、理中湯高劑量、理中湯中劑量和理中湯低劑量組大鼠的口腔潰瘍數量、持續時間減少，間隔時間增加；與陽性對照組比較，理中湯高劑量、理中湯中劑量組大鼠口腔潰瘍數量和持續時間減少，間隔時間延長，理中湯低劑量組大鼠口腔潰瘍數量、持續時間則高于陽性對照組，間隔時間短于陽性對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)(圖 3)。復發性大鼠口腔潰瘍模型具有一定自愈性，模型組大鼠的口腔潰瘍面積隨著時間的延長逐漸縮小，第20天時，除陽性對照組、理中湯高劑量組分別有1只和2只大鼠潰瘍全部愈合外，模型組、理中湯中劑量組和低劑量組大鼠潰瘍均未完全愈合。給藥前一天，各組大鼠口腔潰瘍面積無顯著差異(P>0.05)。在給藥第5、10、15、20天時，與模型組比較，陽性對照組、理中湯高劑量、理中湯中劑量和理中湯低劑量組大鼠口腔潰瘍面積均顯著減小，差異有統計學意義(P<0.05)。與陽性對照組比較，在給藥第5、10、15、20 d時，理中湯高劑量組大鼠口腔潰瘍面積顯著減小，差異有統計學意義(P<0.05)，理中湯中劑量和理中湯低劑量組大鼠口腔潰瘍面積變化則與陽性對照組無顯著差異(P>0.05)(圖 4)。

圖 1 治療20 d時各組大鼠口腔潰瘍情況

圖 2 治療后各組大鼠口腔黏膜組織 (HE,×200)

圖 3 各組大鼠口腔潰瘍數量、持續和間隔時間比較

圖 4 各組大鼠口腔潰瘍面積變化

2.2 理中湯加味對大鼠血清中炎癥因子水平的影響

與正常組比較，其余各組IL-1β、IL-6、TNF-α均增加；與模型組比較，陽性對照組、理中湯高劑量、理中湯中劑量和理中湯低劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α均降低；與陽性對照組比較，理中湯高劑量和中劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量均減少，理中湯低劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量則高于陽性對照組，理中湯加味對大鼠血清炎癥因子的作用呈劑量依賴性，差異均有統計學意義(P<0.05)(圖 5)。

圖 5 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較

2.3 理中湯加味對大鼠潰瘍組織NF-κB炎癥通路的影響

與正常組比較，其余各組IKKα、p-IκBα、NF-κBp65蛋白表達均增加；與模型組比較，陽性對照組、理中湯高劑量、理中湯中劑量和理中湯低劑量組大鼠口腔黏膜組織中IKKα、p-IκBα、NF-κBp65蛋白表達顯著升高；陽性對照組及理中湯高、中和低劑量組口腔黏膜IKKα、p-IκBα、NF-κBp65蛋白表達水平低于模型組；理中湯高、中劑量組口腔黏膜IKKα、p-IκBα、NF-κBp65蛋白表達低于陽性對照組，理中湯低劑量組大鼠口腔黏膜組織IKKα、p-IκBα、NF-κBp65蛋白表達則高于陽性對照組，理中湯加味呈劑量依賴性改變大鼠口腔黏膜組織NF-κB炎癥通路蛋白表達的作用呈劑量依賴性，差異均有統計學意義(P<0.05)(圖 6～7)。

圖 6 Western blot法檢測NF-κB炎癥通路蛋白表達水平

圖 7 各組大鼠口腔黏膜組織NF-κB炎癥通路蛋白相對表達水平比較

3 討 論

ROU是臨床常見口腔黏膜疾病，在中醫學屬于“口瘡”、“口糜”等范圍，臨床表現為口腔黏膜出現反復發作的淺表性潰瘍，伴有灼痛，給患者的生活質量來帶不同程度的影響[12-13]。ROU的發病機制復雜，可能與細菌和病毒感染、微量元素和維生素缺乏、食物和精神因素有關，西醫治療以消炎、止痛、促潰瘍愈合等對癥治療為主，尚無特效藥物，患者在治療期間的依從性較差[14]。近年來，中醫藥在臨床廣泛使用，在治療ROU疾病中具有改善患者癥狀、縮短病程、治愈甚至減少復發的優勢[15-16]。理中湯為我國傳統中醫經典名方，用于治療脾胃虛寒證，具有補氣健脾、溫中祛寒的功效[17]。本研究采用的理中湯加味方包括附子、干姜、黨參、黃芪、白術、茯苓、五味子、山藥、甘草等中藥，方中附子、干姜為君藥，黨參、黃芪為臣藥，白術、茯苓、五味子、山藥共為佐藥，甘草為使藥，全方藥材配伍具有溫中補虛、溫而不燥的特點，可健脾利濕、溫陽散寒，適用于脾胃虛寒癥誘發的口腔潰瘍疾病。NF-κB信號通路是經典的炎癥信號通路，有研究表明，NF-κB信號通路與ROU疾病的發生發展密切相關[18]。因此，本研究以NF-κB炎癥通路為切入點，通過免疫法建立大鼠ROU模型，觀察理中湯加味對大鼠ROU的修復作用，分析其對NF-κB炎癥通路的影響。

結果顯示，除正常組大鼠未出現口腔潰瘍之外，其余大鼠均出現口腔潰瘍。與模型組比較，陽性對照藥物和不同劑量理中湯加味方可減輕大鼠口腔黏膜損傷和炎癥浸潤，減少大鼠口腔潰瘍數量、持續時間和潰瘍面積，延長間隔時間。與陽性對照組比較，除理中湯低劑量組外，高劑量和中劑量理中湯的效果優于陽性對照藥物，表明不同劑量的理中湯加味方對大鼠ROU具有修復作用。ROU疾病的發生往往伴有炎癥因子水平的升高，這是創面愈合的必經階段，機體出現長時間炎癥反應會影響創面血管新生和細胞的正常生長繁殖，并可能造成機體免疫功能發生障礙，對潰瘍創面修復造成嚴重影響，出現“難愈性創面”，因此，降低機體炎癥因子水平對ROU疾病是具有治療作用的[19]。ELISA試劑盒檢測結果顯示，口腔潰瘍模型大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子含量增加。而使用理中湯加味治療后可降低大鼠血清中炎癥因子含量。除理中湯低劑量組以外，理中湯高劑量組和中劑量組大鼠血清中炎癥因子含量均低于陽性對照組，并呈劑量依賴性，表明理中湯加味方可降低ROU大鼠血清中炎癥因子的水平。NF-κB信號通路是經典的炎癥信號通路，其中IKKα、p-IκBα、NF-κB p65在NF-κB炎癥通路的激活中具有重要作用，可參與到潰瘍性疾病的發生與發展過程[20-21]。Surboyo等[22]研究表明，降低NF-κB的表達對糖尿病相關口腔潰瘍的愈合有較強的治療作用。Xie等[23]研究證明，埃索美拉唑通過抗分泌、抑制NF-κB信號通路及抗氧化作用在應激性潰瘍中發揮對胃的保護作用。與上述研究結果一致，在本研究中，ROU模型大鼠潰瘍組織中IKKα、p-IκBα、NF-κB p65等蛋白表達顯著高于正常大鼠，使用理中湯加味治療后，上述蛋白的表達水平則被顯著降低。除理中湯低劑量組以外，理中湯高劑量組和中劑量組IKKα、p-IκBα、NF-κB p65蛋白表達均低于陽性對照組，并呈劑量依賴性，表明理中湯加味方可抑制NF-κB信號通路在ROU疾病中的活化。

綜上所述，理中湯加味方可以減少大鼠口腔潰瘍的發病頻率，縮短潰瘍愈合時間，其機制可能是通過抑制NF-κB炎癥通路發揮對口腔潰瘍黏膜的修復作用。但ROU疾病的發病機制復雜，理中湯加味方是否通過其他途徑發揮抗潰瘍及黏膜修復作用仍需進一步深入探討。