青錢柳內生真菌次生代謝產(chǎn)物抗氧化活性研究

胡世一 周雅琴,2* 安 寧 石忠衡 趙立春 譚小明，3*

1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530200；2.廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023；3.廣西優(yōu)勢中成藥與民族藥開發(fā)工程技術中心，廣西 南寧 530200

人體在正常生理代謝過程中會產(chǎn)生大量的自由基，如過氧化自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基等，它們是人體疾病、衰老和死亡的直接參與者，一般情況下，當體內自由基的產(chǎn)生與清除能力處于平衡狀態(tài)時，受控的自由基對人體是有益的，一旦失衡，體內就會出現(xiàn)“氧化應激”狀態(tài)，這時則需要通過補充抗氧化劑來調整體內自由基平衡，以防止疾病的發(fā)生[1]。日常中，被廣泛應用于化妝品、保健食品和藥物中的抗氧化劑多為人工化學合成制品，存在有諸多毒副作用，難以滿足人們的生活需求[2]。

內生真菌是指生活在健康植物組織器官內部，但不會引起宿主植物出現(xiàn)明顯病害癥狀的一類真菌，包括一些在其生活史的某一階段表面生的腐生菌、潛伏性病原菌和菌根菌[3]。人們對內生真菌的研究始于1993年，美國科學家Stierle首次從太平洋短葉紅豆杉(Taxusbrevifolia)韌皮部中獲得1株能夠生產(chǎn)抗癌物質紫杉醇的內生真菌Taxomycesandreanae[4]。近年來的研究[5]顯示，內生真菌能提高宿主植物對非生物脅迫與生物脅迫的抗逆性，部分內生真菌能自身產(chǎn)生與宿主植物相同或相近的活性成分物質。因此，從植物中分離和篩選出具有抗氧化活性的內生真菌，對食品、醫(yī)藥等工業(yè)具有重要意義。

青錢柳Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinsk.系胡桃科青錢柳屬植物，又名青錢李、山麻柳、山化樹、一串錢、山麻柳、甜茶樹等，為我國特有的單種屬珍稀植物，有植物界大熊貓和醫(yī)學界的“第三顆樹”以及“天然胰島素”的美譽，其樹皮、葉具有清熱消腫、止痛功效，可用于頑癬，集綠化、保健、藥用、材用于一體[6]。研究[7]表明，青錢柳組織中含有黃酮類、酚類、萜類等多種化學成分，具有抗氧化、抗菌及抗腫瘤等活性作用。青錢柳不同溶劑提取物對DPPH、超氧、羥自由基均具有不同強度的清除能力[8]，青錢柳葉70 %乙醇提取物具有較好的抗氧化活性，一些成分的體外抗氧化活性強于VC[9]。但是，現(xiàn)階段國內外有關青錢柳內生真菌的研究報道尚少。研究以青錢柳內生真菌為研究對象，篩選出活性較高的菌株并加以分類鑒定，旨在為尋找新型天然抗氧化劑提供可利用的候選菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料植物 材料于2019年4月采自廣西百色市樂業(yè)縣雅長鄉(xiāng)(E 106°20′；N 24°84′)，由廣西中醫(yī)藥大學譚小明研究員鑒定為青錢柳C.paliurus。131株內生真菌分別從青錢柳的根、莖皮等組織中分離獲得。以上材料采保藏于廣西中醫(yī)藥大學藥學院。

1.2 方法

1.2.1 內生真菌發(fā)酵液制備 在無菌超凈工作臺上，采用PDA平板培養(yǎng)基活化真菌7 d，然后用接種針挑取3個菌塊(直徑為6 mm)，接種到含 100 mL PDA液體培養(yǎng)基錐形瓶(250 mL)中，在轉速為 120 r/min 的搖床上震蕩暗培養(yǎng)10 d(培養(yǎng)溫度為 25 ℃)。發(fā)酵液用4層無菌的干凈紗布過濾。將濾液于 10，000 r/min 條件下離心 10 min，取上清液于 45 ℃，8×103Pa 條件下旋轉蒸發(fā)濃縮至浸膏狀，稱重，加無菌去離子水配成 10 mg/mL 的樣品溶液，保存于 4 ℃ 冰箱備用。

1.2.2 DPPH自由基清除率測定 DPPH法快速、簡便、重現(xiàn)性好，自由基DPPH·在有機溶劑(如甲醇、乙醇)中非常穩(wěn)定，顯紫色，在 517 nm 波長處有強吸收，DPPH溶液與自由基清除劑混合時，顏色由紫色變成淺黃色。參考文獻的方法[12]，以Vc作陽性對照，檢測青錢柳內生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對DPPH·自由基清除能力。清除率的計算公式如：DPPH清除率(%)=[(A0-Ai)/A0]×100，式中：A0為空白對照OD值，Ai為樣品或陽性對照DPPH溶液的OD值。

1.2.3 羥基(·OH-)自由基清除能力測定 OH是毒性最大的活性氧自由基，會引起脂質過氧化作用及造成人體損傷。利用Fenton反應體系法[12]，以Vc作陽性對照，在 510 nm 處檢測青錢柳內生真菌發(fā)酵產(chǎn)物清除·OH-的能力，清除率的計算公式同1.2.2。

1.2.4 亞鐵離子(Fe2+)螯合能力測定 鐵具有高反應活性，能促使機體發(fā)生脂質氧化反應，對亞鐵離子的螯合，可以減少氧化損傷。采用Ferrozine(菲啰嗪)比色法[12]，以EDTA-2Na作陽性對照，在 562 nm 處檢測青錢柳內生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對亞鐵離子的螯合能力，對亞鐵的螯合率計算公式如：Fe2+螯合能力清除率(%)=[(A0-Ai)/A0] × 100，式中：A0為空白對照的OD值，Ai為加有樣品或陽性對照后的OD值。

通過1.2.1-1.2.4方法，綜合篩選出18株活性較好的菌株，作為深入研究對象，進行以下2種抗氧化活性指標的實驗。

1.3 統(tǒng)計分析 采用Excel 2019和DPS 7.05 對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，最小顯著差數(shù)法(LSD)進行單因素方差分析。不同小寫字母表示差異性顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異性極顯著(P<0.01)。

2 結果與分析

2.1 青錢柳內生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對DPPH自由基清除作用 通過DPPH自由基清除試驗發(fā)現(xiàn)，有35株真菌發(fā)酵液清除率高于50%(見表1)，占總供試菌株的25%。其中清除率低于60%高于50%的菌株有10株，編號894F和851F的清除能力最低，均為50.12%；清除率低于70%高于60%的菌株有17株，大于70 %共8株，清除率介于70%～80%之間的菌株有7株，編號分別為913J、885J、892J、909F、882F、937F、820F；清除率高于80%菌株僅1株，編號為937J，為81.32%，131株內生真菌清除DPPH能力均小于VC的清除率85.90%。

表1 青錢柳內生真菌DPPH自由基清除能力測定結果

2.2 青錢柳內生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對·OH-自由基清除作用 共有103株真菌的·OH-清除能力大于50%，占總供試菌株的77%(見表2)。其中清除率在50%至60%的菌株有17株，編號為903J清除率最低，為50.00%；清除率介于60%～70%、70%～80%之間的菌株分別有25株、29株；清除率高于80%低于90%的菌株有32株，其中，共有7株清除率高于陽性對照VC清除率85.83%，編號為824F、894F、907F、885F、890F、912F、876F；菌株912F和876F的清除能力最強，清除率分別為 87.83%、87.74%。

表2 青錢柳內生真菌·OH-自由基清除能力測定結果

續(xù)表2

2.3 青錢柳內生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對Fe2+螯合能力 共計88株內生真菌的Fe2+螯合能力高于50%，占總供試菌的67%(見表3)。清除率大于50%小于60%的菌株有38株，編號930F清除能力最低，為50.14%；清除率在60%至70%之間的菌株36株，清除率高于70%低于80%的菌株有12株，編號為911F、926F、851F、929F、808F、820F、810F、850F、845F、823F、912F、898F；清除率高于80%共有2株，編號為907F、840F，清除率均為82.24%，均低于陽性對照EDTA-2Na清除率85.07%。

表3 青錢柳內生真菌Fe2+螯合能力測定結果

3 討論

內生真菌的生物活性取決于其代謝產(chǎn)物所含的功能性成分。文獻研究表明，目前國內外對青錢柳內生真菌抗氧化和抗菌活性方面的研究報道較少，僅有寇曉琳等[12]對青錢柳內生真菌的抗菌活性進行研究，研究結果從67株內生真菌中篩選出7株菌株具有穩(wěn)定產(chǎn)生黃酮類化合物的能力，進一步的抗菌實驗發(fā)現(xiàn)其中具有較強的抑菌活性作用。相近屬種的其他植物如野核桃[13]和核桃[14]則開展了內生真菌的抗菌和抗氧活性的研究。可見，胡桃科植物內生真菌蘊藏有抗菌、抗氧化等多種代謝活性物質，這同植物與宿主的“共生理論”達成一致，也說明胡桃科植物內生真菌是尋找高抗氧化活性物質的可選資源。