線粒體分裂抑制劑1對NK細胞活化的影響*

陳旭青， 周龍云， 史 軍， 吳繼勇， 嚴芮雯， 嚴道南， 馬華安△

（1南京中醫藥大學附屬醫院耳鼻喉科，江蘇南京 210029；2南京醫科大學第一附屬醫院康復醫學中心，江蘇南京 210029）

自然殺傷（natural killer，NK）細胞是人體非特異免疫系統的組成部分，具有分泌系列細胞因子的潛能［1-2］，其所處微環境不同，細胞因子分泌不一，而發生NK1 或NK2 型活化［3］。研究表明，NK 細胞NK2 型活化釋放Th2型因子，協調T、B 細胞等介導Th2型反應，與多種變應性疾病發生發展密切相關［4-5］，但其異常活化內在機制及調節因素尚不明確。

線粒體是高度動態的網管狀細胞器，通過頻繁地分裂、融合以維持內部穩態，其分裂/融合動態失衡、結構紊亂與多種細胞功能紊亂密切關聯［6］。近年研究顯示，線粒體動態失衡、分裂亢進與NK 細胞異常活化密切相關［7-8］。線粒體分裂抑制劑1（mitochondrial division inhibitor-1，Mdivi-1）為特異性調控線粒體動態變化的通用分子，對線粒體過度分裂觸發的T 細胞、巨噬細胞等免疫細胞功能紊亂具有重要作用［9-10］。基于此，本研究擬選取Mdivi-1 這一選擇性線粒體分裂抑制劑，探討調控線粒體動態變化對NK細胞活化的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 主要儀器 Herocell 180 型CO2培養箱（Thermo）；ELx 800 型酶標儀（BioTek）；ChemiDoc XRS 型化學發光凝膠成像儀和CFX96 Touch 型實時定量PCR 儀（Bio-Rad）；Accuri C6 型流式細胞儀（BD）；DMI 3000B 型倒置熒光顯微鏡和SP8 型激光共聚焦顯微鏡（Leica）。

1.2 主要藥品與試劑 Mdivi-1（貨號M0199）購自Sigma-Aldrich；重組人胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP；貨號300-62）購自PeproTech；α-MEM 培養基、馬血清（horse serum，HS）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和巰基乙醇（貨號11900024、16050122、10100147 和614272）購自Gibico；肌醇、葉酸和PBS 粉末（貨號A600536、A610466 和B040100）購自生工生物工程股份有限公司；Trizol（貨號15596018）購自Thermo；反轉錄試劑盒（貨號RR036A）購自TaKaRa；實時熒光定量PCR試劑盒（貨號11203ES03）購自上海翊圣生物科技有限公司；線粒體超氧化物熒光探針（MitoSOX Red）試劑盒（貨號40778ES50）購自上海翊圣生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、30%丙烯酰胺溶液、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和BCA 蛋白定量試劑盒（貨號ST795、ST626、ST00、ST025 和P0012）購自上海碧云天生物技術有限公司；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（貨號IPVH00010）購自Millipore；兔抗人干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）單克隆抗體、兔抗人p-JAK2 單克隆抗體、抗人JAK2 單克隆抗體、兔抗人p-STAT6 多克隆抗體、兔抗人STAT6 單克隆抗體和兔抗人β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體（貨號ab133566、ab32101、ab108596、ab28829、ab32520 和ab8227）均購自Abcam；小鼠抗白介素4（interleukin-4，IL-4）單克隆抗體和抗人IL-5 多克隆抗體（貨號66142-1-Ig和26677-1-AP）購自Proteintech；細胞計數試劑盒、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔IgG 和HRP 標記的山羊抗小鼠IgG（貨號C0038、A0208 和A0216）購自上海碧云天生物技術有限公司；其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為純化水或超純水。

1.3 實驗細胞 人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的NK細胞系NK-92MI（貨號GOY-ATCC-0016）購自上海谷研實業有限公司。以含12.5%FBS、12.5%HS、0.2 mmol/L 肌醇、0.1 mmol/L 巰基乙醇和0.02 mmol/L 葉酸的α-MEM 培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

2 方法

2.1 細胞活力的測定 回收生長良好的NK-92MI細胞，按每孔90 μL完全培養基，以每孔1×104細胞密度接種細胞于96 孔板中，分為對照組和Mdivi-1 組（終濃度為0.1、0.5、1、5、10、25、50 和100 μmol/L），并設置調零孔。Mdivi-1 組加入10 μL 含不同濃度Mdivi-1 的培養基，對照組加入含0.1% DMSO 的完全培養基。于培養箱中繼續培養24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑孵育1 h。450 nm 波長下，酶標儀檢測每孔吸光度（A）值。

2.2 實驗分組 NK-92MI 細胞分為空白組、TSLP組、1 μmol/L Mdivi-1 組、5 μmol/L Mdivi-1 組和10 μmol/L Mdivi-1 組。TSLP 組細胞以20 μg/L TSLP 刺激24 h，誘導NK 細胞的NK2 分化。Mdivi-1 組于20 μg/L TSLP 刺激下，同時聯合相應濃度Mdivi-1 干預24 h。

2.3 RT-qPCR 回收干預后NK-92MI 細胞，以Trizol試劑分離各組樣本總RNA，并逆轉錄為cDNA。以cDNA 為模板，進行實時定量PCR 擴增。反應體系：SYBR 熒光染料10 μL，正、反義引物各0.4 μL，cDNA 模板2 μL，無核酸酶水7.2 μL。正、反義引物序列見表1。反應條件為：95°C 預變性3 min；95 ℃變性10 s，57 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，39 個循環。以β-actin 為內參照，采用2-ΔΔCt法分析各樣本IL-4、IL-5和IFN-γ的mRNA表達水平。

表1 引物序列RT-gPCRTable 1. Primer sequences for RT-gPCR

2.4 Western blot 分析 回收細胞樣本，經裂解、勻漿、靜置、離心后，獲取蛋白上清。BCA 法測定蛋白濃度，調整終濃度，高溫變性后-80 ℃凍存備用。取蛋白樣品經SDS-PAGE并轉移至PVDF膜上，5%BSA的TBST 室溫封閉后，分別加入以1%BSA 稀釋的抗IL-4、IL-5、IFN-γ、p-JAK2、JAK2、p-STAT6、STAT6 和β-actin 抗體（稀釋比例均為1∶2 000），4 ℃孵育過夜。次日孵育HRP 標記山羊抗兔或小鼠IgG。滴加ECL曝光液，以Bio-Rad 化學發光檢測儀顯影，拍照保存。圖像以ImageJ 1.8.0軟件分析。

2.5 細胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）的檢測 離心收集處理后細胞，以含2 μmol/L MitoSOX Red 的α-MEM 培養基重懸，CO2培養箱中孵育30 min。離心，PBS洗滌，棄上清。500 μL PBS重懸，Accuri C6流式細胞儀檢測熒光強度。

3 統計學處理

所有實驗數據采用GraphPad Prism 7.0.1 軟件行統計學分析。數據均以均數±標準差（mean±SD）表示。組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 Mdivi-1對NK-92MI細胞活力的影響

CCK-8 實驗結果顯示，50 μmol/L 及以內Mdivi-1干預NK-92MI 細胞，其細胞活力無顯著下降。鑒于25 μmol/L Mdivi-1 干預后，細胞活力有一定下降傾向，我們納入1、5和10 μmol/L 濃度Mdivi-1進行后續干預。見圖1。

Figure 1. Effects of Mdivi-1 at different concentrations on the viability of NK-92MI cells. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs 0 μmol/L group.圖1 不同濃度Mdivi-1對NK-92MI細胞活力的影響

2 Mdivi-1 對NK-92MI 細 胞IL-4、IL5 和IFN-γ mRNA和蛋白表達的影響

與對照組比較，TSLP組NK-92MI細胞IL-4和IL-5 的mRNA 表達顯著升高，IFN-γ 的mRNA 表達下降（P＜0.05）；與TSLP 組比較，5 和10 μmol/L Mdivi-1 組IL-4 和IL-5 的mRNA 表達降低，IFN-γ 的mRNA 表達則有所回升（P＜0.05）。Western blot 分析結果顯示，TSLP 刺激后，NK-92MI 細胞IL-4 和IL-5 的蛋白表達升高，而IFN-γ 的蛋白表達有所下調；Mdivi-1 干預后，一定程度上逆轉了TSLP刺激所誘導的IL-4和IL-5 蛋白水平升高及IFN-γ 水平降低，且該效應與藥物劑量呈正相關。見圖2A、表2。

4 Mdivi-1 對NK-92MI 細 胞JAK2 和STAT6 活 化的影響

與對照組比較，TSLP 組NK-92MI 細胞JAK2 和STAT6 蛋白磷酸化水平顯著升高（P＜0.05）；與TSLP組對比，5 和10 μmol/L Mdivi-1 組JAK2 磷酸化水平顯著降低，10 μmol/L Mdivi-1組STAT6磷酸化水平顯著降低（P＜0.05），見圖2B、表2。

表2 各組NK-92MI細胞IL-4、IL-5和IFN-γ mRNA和蛋白表達水平及p-JAK2和p-STAT6蛋白水平的比較Table 2. The expression of IL-4，IL-5 and IFN-γ at mRNA and protein levels，and the protein levels of p-JAK2 and p-STAT6 in each group（Mean±SD. n=3）

5 Mdivi-1對NK-92MI細胞內ROS生成的影響

Figure3. The images of flow cytometry and quantitative analysis of MitoSox Red fluorescence in NK-92MI cells of each group. Mean±SD. n=4.**P＜0.05 vs control group；##P＜0.01 vs TSLP group.圖3 各組NK-92MI細胞MitoSOX Red流式細胞術分析

MitoSOX Red 探針染色顯示，與對照組比較，TSLP 組NK-92MI 細胞的ROS 水平顯著升 高（P＜0.05）；而5 和10 μmol/L Mdivi-1 干預則有效抑制了TSLP 刺 激 下 生 成ROS 水 平 的 升 高（P＜0.01），見圖3。

討 論

NK 細胞為固有免疫重要成員，其異常活化參與多種變應性疾病的發生發展［5，11-12］。近年研究示，NK細胞異常活化隨著線粒體功能紊亂或過度分裂變化［8，13］，但兩者關聯尚不明確。Mdivi-1 為選擇性逆轉線粒體分裂事件的經典化學分子［14］，已被廣泛運用于線粒體動態變化與腫瘤、神經退行性、心血管和自身免疫性疾病等關聯的探索之中［14-15］。我們前期研究示，Mdivi-1可有效抑制脂多糖、谷氨酸等誘導的小膠質細胞和神經元等線粒體分裂，以逆轉過度免疫應答及凋亡事件［16-17］。鑒于Mdivi-1 調控線粒體分裂變化，揭示線粒體動態與諸功能細胞病理變化相因關聯的通用性，本研究選取Mdivi-1 干預異常活化NK 細胞，擬揭示NK 細胞異常活化的潛在機理，并為NK 細胞異常活化的調節尋找可能干預方案具有重要價值。

NK 細胞于不同環境刺激下，可向多個細胞亞型分化。其中NK1 型活化，分泌INF-γ 等標志性因子，促進Th1 型反應；NK2 型分化，則高表達IL-4 和IL-5等經典Th2 型細胞因子，介導變應性炎癥反應［18］。TSLP 則為誘導變應性炎癥、T 細胞Th2 型分化及NK細胞NK2 型活化的重要化學試劑，且對多種免疫細胞線粒體功能蛋白表達及形態變化具有重要影響［19-20］。我們研究顯示，與對照組比較，TSLP 組NK-92MI細胞的IL-4和IL-5蛋白表達顯著提高，IFN-γ的水平相應下調，其符合NK2 型活化表征。與TLSP 組對比，5 和10 μmol/L Mdivi-1 組IL-4 的表達水平降低，IFN-γ 的表達水平有所回升，10 μmol/L Mdivi-1組IL-5 的表達下調。RT-qPCR 結果進一步驗證了Mdivi-1 對TSLP 刺激下NK 細胞IL-4 和IFN-γ 表達偏移的調節作用，提示Mdivi-1 能有效抑制TSLP 刺激所誘導的NK細胞NK2型分化。

JAK2 和STAT6 為調控細胞增殖、分化、膠原合成及免疫應答等生命活動的重要信號分子，其活化參與變應性炎癥的進展，與變應性鼻炎、哮喘和特異性皮炎等疾病發生發展密切相關［21-22］。大量研究表明，T 細胞、B 細胞、肥大細胞和NK 細胞等異常分化，釋放促Th2 型反應因子，常伴隨著內部JAK2 和STAT6 信號分子磷酸化水平升高［23-25］，而抑制JAK2和STAT6 信號分子活化則能有效逆轉其異常活化，改善變應性炎癥反應進程［25-27］。我們的Western blot結果顯示，在20 μg/L TSLP 刺激下，NK-92MI 細胞的p-JAK2 和p-STAT6 蛋白水平顯著升高，符合其NK2型活化內在表現［28］。而Mdivi-1干預后，TSLP誘導的NK-92MI細胞p-JAK2 和p-STAT6 蛋白水平的升高得到一定程度下調，且該效應隨著藥物劑量上調呈增強趨勢。線粒體過度分裂等所致的ROS大量生成是JAK2 和STAT6 等分子活化的重要上游信號，其與變應性反應相關免疫細胞功能紊亂關聯密切［29-30］。MitoSOX Red 染色顯示，在TSLP 刺激下，NK-92MI 細胞ROS 水平明顯升高，5 和10 μmol/L Mdivi-1 干預則能有效逆轉這一現象。上述結果表明，Mdivi-1 抑制TSLP 誘導的NK 細胞NK2型活化可能與其對ROS 及JAK2/STAT6信號通路的調節作用相關。

由于原代NK 細胞培養難度較大，本研究以NK92MI細胞株作為實驗對象，其實驗結果可能存在一定偏倚。本研究中，Mdivi-1 為選擇性發動蛋白相關蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）抑制劑，其通過抑制Drp1 活性實現抑制線粒體分裂，若能選擇Drp1基因沉默技術進一步驗證實驗結果則可提高結論的可靠性。另鑒于Mdivi-1 為線粒體形態調控的經典試劑，本研究未對NK 細胞線粒體形態變化進行復核，或對結果可靠性產生一定影響。于后續進一步機制研究中，我們擬采用電鏡及共聚焦技術對該指標全面檢測。

綜上所述，Mdivi-1能有效抑制TSLP刺激所誘導的NK 細胞NK2 型分化，該效應可能與其對ROS 及JAK2/STAT6 信號分子的調節作用相關。線粒體異常分裂可能是NK細胞異常分化的重要機制。