解偶聯(lián)蛋白1敲除加劇異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌重構(gòu)

鄭 媛付鶴玲侯道榮尹 媛鮑 丹

(南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，南京 210000)

解偶聯(lián)蛋白(uncoupling proteins，UCPs)是陰離子載體蛋白超家族的成員之一，位于線粒體內(nèi)膜，參與線粒體膜電位的調(diào)控[1]。UCPs的發(fā)現(xiàn)，提出了質(zhì)子泄漏學(xué)說(shuō)[2]，即在正常情況下線粒體內(nèi)膜存在一定程度的質(zhì)子泄漏，使線粒體內(nèi)膜的跨膜質(zhì)子梯度減低，以致刺激線粒體呼吸的質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力降低，使線粒體呼吸鏈氧化磷酸化解偶聯(lián)，導(dǎo)致ATP數(shù)量減少，能量以熱能的形式釋放。研究發(fā)現(xiàn)，UCPs可減少線粒體氧化磷酸化過(guò)程中ROS的產(chǎn)生[3]。

UCP1，又稱(chēng)產(chǎn)熱素，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的UCPs，主要在哺乳動(dòng)物棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)中表達(dá)[4]。UCP1和(或)BAT被激活后，棕色脂肪細(xì)胞會(huì)消耗葡萄糖和脂質(zhì)，將能量從葡萄糖和游離脂肪酸氧化轉(zhuǎn)換成熱量[5]。這種獨(dú)特的代謝產(chǎn)熱方式，使UCP1和BAT成為肥胖和2型糖尿病治療的研究熱點(diǎn)[6]。

本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)，UCP1在大鼠心臟組織中表達(dá)，并在異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)模型[7]大鼠心臟組織中表達(dá)顯著升高；Ucp1基因敲除導(dǎo)致心室壁和心收縮功能在ISO誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)急性期顯著增加，但Ucp1基因敲除對(duì)心肌重構(gòu)的長(zhǎng)期影響仍未知。因此，本文旨在通過(guò)已建立的Ucp1基因敲除大鼠(Ucp1－/－)分析Ucp1基因敲除后對(duì)ISO誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)的長(zhǎng)期影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)所用Ucp1－/－大鼠由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所制作，同時(shí)敲除大鼠培育過(guò)程中使用的SD大鼠均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2019-0011]，大鼠飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障設(shè)施的飼養(yǎng)間[SYXK(蘇)2020-0022]，飼養(yǎng)間溫度(23±2)℃，12 h/12 h明/暗燈照，動(dòng)物自由飲水和攝食。實(shí)驗(yàn)中所使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為野生型(雌雄各6只)和Ucp1－/－(雌雄各6只)清潔級(jí)SD大鼠，8周齡，體重約250 g。實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物操作程序均遵循3R原則并已取得南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)(IACUC-1704011)。

1.2 主要試劑與儀器

ISO(I6504)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)生化檢測(cè)試劑(990-63193)購(gòu)自日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase isoenzyme MB，CKMB)生化檢測(cè)試劑(H007 T)購(gòu)自中國(guó)美康生物科技股份有限公司；小動(dòng)物超聲(Vevo 2100)購(gòu)自加拿大VisualSonics公司；全自動(dòng)血生化分析儀(7100)購(gòu)自日本日立公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 ISO誘導(dǎo)心肌重構(gòu)大鼠模型

選用2月齡野生型(wild type，WT)大鼠和Ucp1－/－大鼠腹腔注射生理鹽水或ISO(30 mg/(kg·d)，連續(xù)3 d)建立大鼠心肌重構(gòu)模型。大鼠隨機(jī)分成4組:WT生理鹽水組、Ucp1－/－生理鹽水組、WTISO組和Ucp1－/－-ISO組(n＝6)。

1.3.2 M型超聲心動(dòng)圖檢測(cè)大鼠心臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能

于生理鹽水或ISO注射后1個(gè)月，分別對(duì)4組大鼠進(jìn)行M型超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。大鼠經(jīng)1.5%異氟烷氣體麻醉，脫胸前區(qū)被毛，仰臥固定于加熱板上，以保持體溫，四肢固定，選用MS250的探頭，進(jìn)行心臟超聲影像分析[8]。

1.3.3 大鼠血清中CK-MB和LDH水平的檢測(cè)

于生理鹽水或ISO注射后1個(gè)月，大鼠經(jīng)4%異氟烷氣體麻醉，打開(kāi)腹腔，鈍性分離暴露腹主動(dòng)脈，從腹主動(dòng)脈分別采集4組大鼠3 mL外周血，室溫放置1 h后，3000 r/min，4℃離心10 min，獲取血清。利用全自動(dòng)血生化分析儀測(cè)定LDH和CK-MB水平。

1.3.4 病理組織學(xué)觀察大鼠的心肌細(xì)胞形態(tài)和間質(zhì)纖維化

于生理鹽水或ISO注射后1個(gè)月，二氧化碳法處死大鼠，打開(kāi)胸腔取出心臟，將心臟組織固定在中性福爾馬林24 h后進(jìn)行修塊、脫水、包埋、切片、蘇木素-伊紅(haematoxylin-eosin，HE)染色和Masson染色，鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理分析。如果數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行組間比較，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步采用Tukey’s post-hoc檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ucp1基因敲除加劇了ISO誘導(dǎo)的急性心肌缺血模型大鼠左心室的不利重構(gòu)

于生理鹽水或ISO注射后1個(gè)月，分別對(duì)4組大鼠進(jìn)行M型超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。結(jié)果顯示，生理鹽水組，與WT大鼠相比，Ucp1－/－大鼠左心室收縮末期后壁厚度顯著減小了11.63%(P<0.01，圖1A)，左心室內(nèi)徑呈增大且心收縮功能下降的趨勢(shì)。ISO組WT大鼠左心室收縮末期前壁厚度顯著增加了37.07%(P<0.001)，說(shuō)明WT大鼠仍處于ISO誘導(dǎo)的室壁肥厚代償期；而Ucp1－/－大鼠左心室收縮末期前壁厚度未顯著增加，且與WT大鼠相比，Ucp1－/－大鼠左心室收縮末期前壁厚度顯著減小了14.10%(P<0.05，圖1B)，說(shuō)明Ucp1－/－大鼠已由代償期向失代償期轉(zhuǎn)換。再者，ISO的誘導(dǎo)導(dǎo)致WT大鼠和Ucp1－/－大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)均顯著降低(P<0.01，P<0.001)，且Ucp1－/－大鼠的左心室射血分?jǐn)?shù)顯著低于WT大鼠(P<0.05)，說(shuō)明Ucp1基因敲除顯著加劇了ISO誘導(dǎo)的心收縮功能減退(圖1C~H)。

圖1 ISO誘導(dǎo)后1個(gè)月WT和Ucp1－/－大鼠心臟M型超聲心動(dòng)圖分析Figure 1 M-mode echocardiography analysis of WT and Ucp1－/－rats at 1 month after ISO administration

2.2 Ucp1基因敲除升高了ISO誘導(dǎo)的急性心肌缺血模型大鼠血清中心肌損傷標(biāo)志物水平

于生理鹽水或ISO注射后1個(gè)月，分別對(duì)4組大鼠進(jìn)行血清LDH和CK-MB水平的檢測(cè)。結(jié)果顯示，生理鹽水組，與WT大鼠相比，Ucp1－/－大鼠血清LDH水平顯著升高(P<0.05，圖2A)。ISO組與生理鹽水組相比，WT和Ucp1－/－大鼠血清LDH水平均顯著升高(P<0.05，圖2A)；Ucp1－/－大鼠血清CKMB水平顯著升高(P<0.01，圖2B)。此外，ISO注射后1個(gè)月，Ucp1－/－大鼠血清LDH和CK-MB水平均顯著高于WT大鼠(P<0.01，P<0.05，圖2B)。

圖2 ISO誘導(dǎo)后1個(gè)月WT和Ucp1－/－大鼠血清中心肌損傷標(biāo)志物水平檢測(cè)Figure 2 Serum marker of myocardial injury analysis of WT and Ucp1－/－rats after ISO administration 1 month

2.3 Ucp1基因敲除加劇了ISO誘導(dǎo)的急性心肌缺血模型大鼠的病理組織學(xué)表型

于生理鹽水或ISO注射后1個(gè)月，分別對(duì)4組大鼠進(jìn)行心臟病理組織學(xué)表型分析。結(jié)果顯示，生理鹽水組，WT大鼠和Ucp1－/－大鼠心肌細(xì)胞排列和間質(zhì)纖維化程度無(wú)顯著差別。ISO組與WT大鼠相比，Ucp1－/－大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂(圖3A、B)和間質(zhì)纖維化(圖3C)程度更加嚴(yán)重。

圖3 ISO誘導(dǎo)后1個(gè)月WT和Ucp1－/－大鼠病理組織學(xué)表型分析Figure 3 Histopathological phenotyping analysis of WT and Ucp1－/－rats after ISO administration 1 month

3 討論

在對(duì)ISO誘導(dǎo)的大鼠心肌重構(gòu)模型的長(zhǎng)期觀察過(guò)程中，本研究發(fā)現(xiàn)，Ucp1基因敲除顯著加劇了ISO誘導(dǎo)的大鼠心臟的病理進(jìn)程發(fā)展。具體表現(xiàn)為:ISO誘導(dǎo)后1個(gè)月，與WT大鼠相比，Ucp1－/－大鼠左心室室壁厚度顯著變薄、射血分?jǐn)?shù)顯著降低；血清中心肌損傷標(biāo)志物L(fēng)DH和CK-MB水平顯著增高；心肌細(xì)胞排列紊亂和間質(zhì)纖維化程度更加嚴(yán)重。

UCP1主要在哺乳動(dòng)物BAT中表達(dá)。心肌細(xì)胞損傷發(fā)生后，交感神經(jīng)激活，去甲腎上腺素釋放[9]，合并利尿肽釋放[10]，這些分子均是BAT生長(zhǎng)和激活的重要影響因子。ISO是β腎上腺素能受體的一種非選擇性的激動(dòng)劑，被廣泛地運(yùn)用于心肌肥厚和心力衰竭的動(dòng)物模型的構(gòu)建[11]。ISO誘導(dǎo)的動(dòng)物模型心臟組織的病理學(xué)和形態(tài)改變被認(rèn)為是最接近臨床上心臟病人的體征的。因此，本研究選用ISO構(gòu)建大鼠心肌重構(gòu)模型以及前期建立的Ucp1－/－大鼠來(lái)明確Ucp1基因敲除對(duì)缺血性心臟疾病的長(zhǎng)期影響是具有理論支撐和科學(xué)可行性的。

本研究發(fā)現(xiàn)，Ucp1基因敲除后，生理鹽水組，與WT大鼠相比，Ucp1－/－大鼠血清LDH水平顯著升高，說(shuō)明Ucp1基因敲除在生理狀況下可能對(duì)心肌就存在一定的損傷刺激；此外，Ucp1基因敲除后，ISO誘導(dǎo)的大鼠心肌重構(gòu)長(zhǎng)期病理表型亦顯著加劇，上述表型改變可能跟Ucp1基因敲除后BAT功能障礙相關(guān)。已有研究證實(shí)BAT的生物學(xué)功能受Ucp1的調(diào)控[12]，Ucp1－/－小鼠BAT激活能力受損[13]。此外，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，BAT及其相關(guān)組織還具有調(diào)節(jié)多種心血管風(fēng)險(xiǎn)因子的功能。血管周周和心外膜脂肪組織(類(lèi)似BAT[14])參與動(dòng)脈粥樣硬化和血壓的調(diào)節(jié)[15]。體外穩(wěn)轉(zhuǎn)Ucp1的H9C2細(xì)胞可抵抗缺氧/再氧化的損傷，提高心肌細(xì)胞的存活率，保留線粒體正常的結(jié)構(gòu)和功能，減少缺氧后ROS的產(chǎn)生[16]；轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)Ucp1的小鼠也可抵抗缺血/再灌注的損傷，顯著改善再灌注階段心功能的恢復(fù)[17]。現(xiàn)有研究結(jié)果和本研究結(jié)果從正反兩方面共同驗(yàn)證了UCP1的心臟保護(hù)性作用，但其潛在的分子機(jī)制仍需大量的后續(xù)研究證實(shí)。

綜上所述，Ucp1基因敲除會(huì)加劇ISO誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)的長(zhǎng)期病理表型，增加UCP1的表達(dá)對(duì)缺血性心臟病具有保護(hù)作用，這為臨床上防治藥物的研發(fā)提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。