草烏甲素通過JAK2/STAT3通路抑制Nav1.6表達減輕奧沙利鉑誘發的神經病理性疼痛*

劉高麗， 劉 靜， 王江栓， 吳 松

（1漯河醫學高等專科學校醫學檢驗技術教研室，河南漯河 462002；2鄭州大學附屬鄭州中心醫院重癥監護室，河南鄭州 450000；3漯河醫學高等專科學校人體解剖學教研室，河南漯河 462002；4漯河醫學高等專科學校計算機教研室，河南漯河 462002）

奧沙利鉑（oxaliplatin，OXA）為用于腫瘤化療的第三代鉑類抗腫瘤藥物，對晚期和/或轉移性消化道腫瘤等均具有較好療效［1］。隨著臨床廣泛的應用，神經病理性疼痛（neuropathic pain，NP）被發現為其主要局限性并發癥，導致部分患者不得不終止治療，影響患者生活質量［2］。由于對OXA 引起NP 的機制缺乏深入了解，因此目前尚缺乏針對性的治療。草烏甲素（bulleyaconitine A，BLA）為分離自烏頭（Aconitum bulleyanumDiels）根莖中的萜類生物堿，為我國自主研發的有效鎮痛劑，臨床已用于治療風濕和類風濕性關節炎、腰肌勞損等引起的慢性疼痛［3］。研究發現，BLA 可降低辣椒素受體瞬時受體電位香草酸1 型（transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1）的表達和神經元凋亡，減輕神經機械損傷所致的NP［4］。另有研究顯示，草烏甲素可減輕紫杉醇引起的NP，但未對其作用機制進行探討［5］，而其對OXA所致NP的治療效果及作用機制均不清楚。

Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信號轉導和轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號通路可通過作用于多種蛋白而調節細胞增殖、分化、免疫和炎癥等生物學過程［6］。JAK2及其底物STAT3 主要分布在神經系統中，可調節多種神經遞質受體和離子通道蛋白的表達，其過度活化與大鼠NP 癥狀同步，抑制其活化可作為治療NP的新靶點［7-8］。在骨癌相關疼痛模型中，JAK2/STAT3信號通路的活化可上調電壓門控鈉通道（voltagegated sodium channels，Nav）等通道蛋白表達，增強背根神經節（dorsal root ganglion，DRG）神經元興奮性，引起疼痛的發生［9］。Li 等［10］研究發現，Nav1.6 在DRG 中高表達參與OXA 所致大鼠NP 的病理過程。本研究推測BLA 可能通過作用于JAK2/STAT3 通路調控Nav1.6 表達，進而減輕OXA 誘發的NP，并通過建立OXA誘導的大鼠NP模型對此進行研究。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

成年雄性SPF 級Wistar 大鼠（200～220 g），購自河南省實驗動物中心，許可證號為SCXK（豫）2017-0001。大鼠均在本校動物實驗中心的動物房中常規飼養，適應1周后開始實驗。

2 主要試劑及儀器

BLA 購自云南昊邦制藥公司；注射用奧沙利鉑購自齊魯制藥公司；JAK3 激動劑C-A1 購自MedChemExpress；抗JAK2 和p-JAK2 單克隆（兔）抗體及羊抗兔Ⅱ抗購自CST；抗Nav1.6 多克隆（兔）及STAT3和p-STAT3單克隆抗體購自Abcam；BCA蛋白定量試劑盒和ECL 發光試劑盒購自Thermo；RNA TriPure 試劑、反轉錄和FastStart?PCR Master 定量PCR 試劑盒購自Roche。Western blot 實驗裝置購自BioRad；定量熒光PCR 儀購自Roche；膜片鉗放大器購自HEKA。

3 方法

3.1 模型制備和分組 大鼠分別于第1、2、7、8、14、15、21 和22 天，每天腹腔注射1 次OXA（4 mg/kg），制備OXA誘發的NP模型，對照組大鼠相同時間注射等量5%葡萄糖注射液［11］。首先，為明確BLA 對OXA大鼠的治療作用，將模型大鼠分為OXA 組及0.04 mg/kg、0.12 mg/kg和0.36 mg/kg BLA 治療組，并設置對照組，每組8 只。然后，為明確JAK2/STAT3 信號通路在BLA 治療過程中所發揮的作用，給予0.36 mg/kg BLA 治療的OXA 大鼠同時注射JAK3 激動劑C-A1，組別設置為OXA組、0.36 mg/kg BLA治療組和0.36 mg/kg BLA 及C-A1 合用治療組，每組8 只。在OXA 誘發期間，BLA 采用灌胃給藥，JAK3 激動劑CA1 采用腹腔注射給藥（給藥劑量100 μg/kg），每天1次，共給藥28 d。

3.2 行為學檢測 分別在制模前和注射OXA 后第7、14、21和28天，采用von Frey 細絲實驗和冷板實驗對大鼠的疼痛敏感度進行分析。von Frey 細絲實驗中采用已校準的細絲（2.0～26.0 g）對大鼠右后爪底中心皮膚進行垂直刺激，每次時間3 s，以右后爪快速退縮為陽性反應。若有響應則施加下一個較低質量的細絲；若無響應則施加下一個更高質量的細絲。記錄能夠引起陽性反應的最低質量（g），記為機械縮爪閾值。為了避免測試對大鼠的傷害，von Frey 細絲最高質量為26.0 g，且每次實驗間隔5 min。冷板實驗中，將大鼠置于放置有8 ℃冷板的透明塑料盒內，將大鼠左后爪接觸冷板，記錄其左后爪撤縮時間，即為冷刺激縮爪潛伏期。為避免傷害，切斷時間為20 s，且每次實驗間隔5 min。

3.3 電生理檢測［9］大鼠麻醉斷頭后，取雙側L4～L6 DRG 部分組織剪碎，采用膠原酶Ⅰ（1 g/L）和中性蛋白酶Ⅱ（5 g/L）消化后，離心棄上清，采用完全培養基懸浮沉淀以獲取單個神經元懸液。將上述神經元懸液加至細胞爬片（0.1 g/L賴氨酸包被）上培養2 h 后，采用膜片鉗放大器采集誘發動作電位的最小電流、靜息膜電位（resting membrane potential，RMP）和300 pA電流下動作電位數量，以此表示其興奮性。

3.4 Western blot 檢測蛋白水平 將L4～L6 DRG 組織置于-80 ℃保存。檢測時，采用蛋白提取試劑盒提取后，采用BCA 試劑盒定量蛋白濃度。制備SDSPAGE，每組取30 μg蛋白變性后進行電泳分離，之后在半干轉膜裝置中轉印到PVDF 膜。轉膜成功后采用脫脂奶粉溶液封閉2 h，接著分別加入Ⅰ抗β-actin（1∶5 000）、Nav1.6（1∶500）、JAK2（1∶1 000）、STAT3（1∶2 000）、p-JAK2（1∶1 000）、STAT3（1∶2 000）抗體稀釋液，4 ℃過夜后漂洗3 次，加入Ⅱ抗稀釋液（1∶5 000）室溫孵育1.5 h 后漂洗3 次，加入ECL 發光試劑顯色。采用TANON 成像系統拍攝蛋白條帶并進行灰度值分析。

3.5 RT-qPCR 檢測 將DRG 組織置于TriPure 試劑中勻漿，加入氯仿/異丙醇抽提、乙醇洗滌后離心收集沉淀，干燥后加入RNase-free 水溶解獲得RNA。采用逆轉錄試劑盒將其反轉為cDNA，作為RT-qPCR反應體系的模板，采用FastStart?PCR Master 定量PCR 試劑盒進行擴增。采用2-ΔΔCt法以GAPDH 為內參照計算Nav1.6 mRNA 的相對水平。所需引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The primer sequences for RT-qPCR

4 統計學處理

采用GraphPad 8.0 和SPSS 22.0 對數據進行分析。計量數據以均數±標準差（mean±SD）表示，采用單因素方差分析進行多組間比較，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 草烏甲素減輕NP模型大鼠機械痛和冷痛敏感度

注射OXA 7、14、21 和28 d 后，與對照組比較，OXA 組機械痛和冷痛閾值明顯減低（P＜0.05）。治療14、21 和28 d 后，與OXA 組比較，0.12 mg/kg 和0.36 mg/kg 草烏甲素均可顯著升高大鼠的機械痛和冷痛閾值（P＜0.05）。治療21、28 d 后，0.04 mg/kg 草烏甲素可顯著提高大鼠的冷痛閾值（P＜0.05），但對機械痛閾值無明顯影響（P＞0.05）。0.12 mg/kg 和0.36 mg/kg 草烏甲素對機械痛和冷痛閾值的改善作用 明 顯 優 于0.04 mg/kg 草 烏 甲 素（P＜0.05）。見圖1。

Figure 1. Comparison of mechanical paw withdrawal threshold（A）and paw withdrawal lantency to cold stimulation（B）in each group. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs OXA group；&P＜0.05 vs 0.04 mg/kg BLA+OXA group.圖1 各組機械痛閾值及冷痛閾值的比較

2 草烏甲素抑制NP模型大鼠神經元的興奮性

注射OXA 28 d 后，與對照組比較，OXA 組神經元的RMP 和動作電位數量明顯增高，誘發動作電位的最小刺激電流明顯減低（P＜0.05）；治療28 d后，與OXA 組比較，0.12 mg/kg 和0.36 mg/kg 草烏甲素可顯著減低RMP 和動作電位數量，并提高誘發動作電位的最小刺激電流（P＜0.05），0.04 mg/kg 草烏甲素則僅可顯著提高誘發動作電位的最小刺激電流（P＜0.05）。與0.04 mg/kg 草烏甲素組比較，0.12 mg/kg和0.36 mg/kg 草烏甲素組神經元的興奮性顯著增加（P＜0.05）。見圖2、表2。

表2 各組神經元興奮性的比較Table 2. Comparison of excitability of neurons in each group（Mean±SD. n=8）

Figure 2. Comparison of the number of action potentials of neurons in each group.圖2 各組神經元動作電位數量的比較

3 草烏甲素抑制NP 模型大鼠Nav1.6 的mRNA 和蛋白表達

注 射OXA 28 d 后，與 對 照 組 比 較，OXA 組Nav1.6 的mRNA 和蛋白表達明顯增高（P＜0.05）。治療28 d 后，與OXA 組比較，0.12 mg/kg、0.36 mg/kg草烏甲素可顯著降低Nav1.6 的mRNA 和蛋白表達（P＜0.05），0.04 mg/kg 草烏甲素則對其表達無明顯影響（P＞0.05）。0.12 mg/kg 和0.36 mg/kg 草烏甲素對Nav1.6 mRNA 和蛋白表達的抑制作用強于0.04 mg/kg草烏甲素（P＜0.05）。見圖3A、圖4。

4 草烏甲素抑制NP 模型大鼠JAK2/STAT3 通路活化

注射OXA 28 d 后，與對照組比較，OXA 組DRG組織中p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平明顯增高（P＜0.05）；治療28 d 后，與OXA 組比較，0.12 mg/kg 和0.36 mg/kg 草烏甲素可顯著減低OXA 誘導的大鼠DRG 組 織 中p-JAK2 和p-STAT3 的 蛋 白 水 平（P＜0.05），0.04 mg/kg 草烏甲素則對JAK2 和STAT3 磷酸化無明顯調節作用（P＞0.05）。0.12 和0.36 mg/kg草烏甲素對JAK2 和STAT3 磷酸化的抑制作用強于0.04 mg/kg草烏甲素（P＜0.05）。見圖3B、圖4。

Figure 3. The images of Western blot for determining the protein levels of Nav1.6（A），and JAK2，STAT3，p-JAK2 and p-STAT3（B）in the rats of each group.圖3 Western blot檢測各組大鼠Nav1.6、JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3蛋白水平的變化

Figure 4. Comparison of Nav1.6 expression at mRNA and protein levels，and protein levels of p-JAK2 and p-STAT3 in each group.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs OXA group；&P＜0.05 vs 0.04 mg/kg BLA+OXA group.圖4 各組Nav1.6的mRNA和蛋白表達及p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3蛋白水平的比較

5 草烏甲素調控JAK2/STAT3通路抑制Nav1.6的表達和神經元興奮性

與OXA 組比較，0.36 mg/kg 草烏甲素可顯著降低OXA 大鼠DRG 組織中p-JAK2、p-STAT3 和Nav1.6的蛋白水平及動作電位數量（P＜0.05）；與0.36 mg/kg 草烏甲素組比較，JAK2 激活劑C-A1 可顯著減弱草烏甲素對OXA 誘導的大鼠DRG 組織p-JAK2、p-STAT3和Nav1.6的蛋白水平及動作電位數量的作用（P＜0.05）。見圖5、6。

Figure 5. Effect of bulleyaconitine A（BLA）on Nav1.6 protein expression（A）and number of action potentials（B）of neurons by regulating JAK2/STAT3 signaling pathway.圖5 草烏甲素調控JAK2/STAT3通路對Nav1.6蛋白表達和對神經元動作電位數量的影響

討 論

臨床中目前通常以抗抑郁、抗驚厥等藥物治療化療性NP，但效果并不能達到預期目標，且會產生一定副作用［12］，因此尋找安全有效的治療藥物仍有必要。草烏甲素為提取自天然產物的鎮痛劑，廣泛應用于臨床中多種疼痛的治療。本研究發現，給予草烏甲素治療后，OXA 誘導NP大鼠的機械痛和冷痛閾值明顯增高，可見草烏甲素可降低OXA 大鼠的疼痛敏感度，表明草烏甲素對化療性NP 也有一定治療作用。OXA 和其他化療藥物一樣，主要積累在DRG中并損傷周圍神經，引起大鼠DRG 中神經元過度興奮和Nav1.6表達上調，降低Nav1.6表達可降低神經元興奮性并減輕NP 癥狀［10］。本研究在OXA 誘導的大鼠DRG 中觀察到了同樣的變化，且0.12 mg/kg、0.36 mg/kg 草烏甲素均可明顯抑制Nav1.6 表達，降低神經元靜息膜電位和動作電位數量，并提高誘發動作電位的最小電流。由于電壓門控鈉離子通道在神經中廣泛分布，其改變可直接調節神經元的興奮性，引起非正常異位放電，而非正常異位放電又是NP 發生的病理生理基礎之一［13］。其中，Nav1.6 廣泛分布于神經系統包括中樞神經系統和DRG 神經元中，位于傷害性感覺神經元的胞體和軸突起始端。Nav1.6 在DRG 中高表達，可使鈉離子通道失活率降低及復位速度加快，增加神經元興奮性，參與異位放電的形成，引起疼痛，敲除DRG 中Nav1.6可減弱神經損傷處神經元的興奮性，減輕神經損傷誘導的機械性異常疼痛［14］。另外，Nav1.6 參與2 型糖尿病患者病理性神經痛的發生過程，而Nav1.6在DRG 中的上調也參與骨癌痛的發生過程［15］。因此推測草烏甲素減輕OXA 誘導的大鼠NP 癥狀可能與其調控Nav1.6表達和神經元興奮性有關。

Figure 6. Comparison of protein levels of p-JAK2，p-STAT3 and Nav1.6，and neuronal action potential number（APN）in each group. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs OXA group；#P＜0.05 vs BLA group.圖6 各組p-JAK2、p-STAT3和Nav1.6蛋白水平及神經元動作電位數量的比較

已有研究表明，神經中Nav1.6 等表達異常可導致神經元興奮性增加，并引起NP 等癥狀［16］，但其分子機制尚不明確。JAK2/STAT3 通路在多種NP 疾病中起重要作用，在神經損傷引起的NP 大鼠中發現，JAK2/STAT3 信號通路通過上調損傷神經中炎癥因子的表達來介導NP 的維持［17］。紫杉醇可增加JAK2和STAT3 的磷酸化，誘導JAK2/STAT3 通路活化，損傷神經系統，產生疼痛［18］。本研究中，草烏甲素可顯著降低OXA 誘導的大鼠DRG 神經元中上調的p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平，揭示了草烏甲素對JAK2/STAT3 通路的抑制作用。然而，STAT3 途徑的激活可引起Nav1.6 的表達上調，導致L5-VRT 誘導的神經性疼痛［19-20］。為進一步明確JAK2/STAT3信號通路在草烏甲素改善OXA 誘導大鼠NP 癥狀中的作用，本研究采用JAK 激動劑進行研究。與草烏甲素單一干預組比較，JAK2 激動劑可顯著減弱草烏甲素對OXA 誘 導 的 大 鼠DRG 組 織p-JAK2、p-STAT3 和Nav1.6 蛋白水平的調控作用，進一步驗證了草烏甲素對OXA 誘導的大鼠JAK2/STAT3 通路的調節作用，同時提示草烏甲素對OXA 誘導的大鼠DRG 組織Nav1.6 表達的調控作用可能與其調節JAK2/STAT3通路有關。也有研究指出，蛋白酶激活受體2（proteinase-activated receptor 2，PAR2）和磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）通路也可能為藥物治療OXA 誘導NP 的作用靶點［21-22］。而本研究也顯示，JAK2 激動劑并不能完全逆轉草烏甲素對JAK2/STAT3通路和Nav1.6蛋白的調節作用，提示草烏甲素調節Nav1.6 蛋白、減輕OXA 誘導的大鼠NP癥狀的分子機制可能涉及其它通路，值得繼續探究。

綜上所述，本研究認為草烏甲素可調節JAK2/STAT3 通路，繼而通過抑制Nav1.6 蛋白表達而降低神經元興奮性，從而減輕OXA誘導大鼠的NP癥狀。