基于水通道蛋白3和核轉錄因子-κB信號通路探討電針神闕穴對功能性便秘胃腸動力的改善機制

謝林林，趙玉粒，黃明桂，古遠云

(1.西南醫科大學附屬中醫醫院經典中醫診療中心，四川 瀘州 646000；2.西南醫科大學附屬中醫醫院老年病科，四川 瀘州 646000)

功能性便秘是一種與一些胃腸道表現相關的慢性疾病，影響5%～30%的人口，女性和老年人的發病率較高，嚴重影響患者的生活質量。目前治療便秘的方法主要包括多糖、膳食纖維、瀉藥、生物反饋療法和外科治療等，但這些治療策略的療效有限，且很少有關于這些療法的長期臨床研究。電針療法是中醫常用的一種外治法，通過在傳統針刺的基礎上增加外部電刺激，可使刺激倍增，治療效果也相應提高。目前，電針已被各科醫生廣泛應用于治療各類疾病，取得了滿意的療效。神闕穴位于臍中，與腸腑相隔，刺激該穴位可健運脾胃。然而，電針神闕穴通便作用的分子機制尚未闡明。水通道蛋白(aquaporin，AQP)是水和水/甘油通道，負責水通過膜的快速運輸，目前已鑒定出13種AQP(AQP0—AQP12)。其中，AQP3是結腸中最重要的AQP，與慢性便秘密切相關，有研究表明，AQP3介導了瀉藥的通便作用。核轉錄因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)在免疫反應和炎癥反應過程中起重要作用。報道顯示，AQP3通過NF-κB途徑調節腸易激綜合征大鼠的液態水代謝異常和腸通透性改變。因此，本研究旨在探討電針神闕穴對功能性便秘模型大鼠AQP3蛋白和NF-κB信號的影響，并初步探討其改善功能性便秘胃腸動力的機制。

1 材料

1.1 實驗動物 健康SD大鼠40只，體質量(230±20)g，購自四川大學華西醫院，使用許可證號為SYXK(川)2018-119，生產許可證號為SCXK(川)2018-026。大鼠飼養于恒溫(23±2)℃、相對濕度55%±5%的環境中，常規24 h晝夜循環，并按照實驗動物使用的“3R”原則給予人道關懷，實驗過程嚴格遵守實驗動物管理條例。

1.2 主要試劑及儀器 鹽酸洛哌丁胺(批號 140709510)：西安楊森制藥；蓯蓉通便口服液(批號 Z10910032)：甘肅天水岐黃藥業；蘇木素染液(批號 C200301)、伊紅染液(批號 C200403)：珠海貝索生物；胃動素(motilin，MTL；批號 ZC-37312)、胃泌素(gastrin，GAS；ZC-37314)、P物質(substance P，SP；批號 ZC-36170)、環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2；批號 ZC-36713)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β；ZC-M6681)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6；ZC-36404)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α；ZC-37624)ELISA 試劑盒：上海茁彩生物；一抗AQP3(批號 AF5222)、囊性纖維化跨膜傳導調節因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)(批號 DF10310)、蛋白激酶A(protein kinase A，PKA；批號 AF7746)、磷酸化核轉錄因子-κB p65(phosphorylated nuclear transcription factor-κB p65，p-NF-κB p65；批號 AF2006)、核因子κB抑制蛋白α(inhibitor of nuclear factor-kappa B，IκBα)(批號 AF5002)、ECL發光試劑盒(批號 KF001)：Affinity；生物素化山羊抗兔IgG(重鏈+輕鏈；批號 ab6721)：英國abcam；RNA Trizol試劑(vs18061730)：合肥博美生物；TB GreenPremix Ex TaqⅡ(批號 RR820A)：寶日醫生物；BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號 P0009)：Beyotime；PIKO Red 96實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀、MK3全功能酶標儀：美國Thermo Fisher。

2 方法

2.1 功能性便秘大鼠模型構建及分組 將大鼠隨機分為空白組(

n

=10)，模型組(

n

=30)。大鼠模型復制步驟如下：每只大鼠每日僅給予日平均飲水量的1/3，并灌胃鹽酸洛哌丁胺1.5 mg/kg，頸背部皮下注射D-半乳糖125 mg/kg，不限制進食。空白組大鼠給予等量超純水灌胃，頸背部皮下注射等量生理鹽水，不限水，不限制進食。大鼠出現精神狀態差，活動量減少，大便粒型小、干硬等表現為模型復制成功。將模型復制成功的大鼠隨機分為模型組、蓯蓉通便口服液組、電針治療組，每組10只。

2.2 干預方法 電針治療組每日9：00將大鼠仰臥固定，電針大鼠神闕穴(胸腹正中線上，劍突至恥骨聯合上緣上2/3與下1/3交界處)，進針5 mm左右，每日1次，每次30 min，5次為1個療程，療程中間休息2 d，共治療2個療程。穴位定位則參照《大鼠穴位圖譜的研制》以及李忠仁主編的《實驗針灸學》，電針參數參考曹洋等研究結果：強度2 mA，疏密波(疏波4 Hz，密波50 Hz)，以大鼠下肢稍震動為宜。為了避免強制固定時所導致的應激反應誤差，空白組和模型組大鼠每日只固定不做任何處理，蓯蓉通便口服液組大鼠每日固定并以0.3 mL蓯蓉通便口服液灌胃，連續14 d。

2.3 炭末推進實驗及糞便含水量測定 治療結束后，每組取5只大鼠灌胃墨汁，40 min后將大鼠脫頸椎處死，分離腸系膜。從幽門至炭末前沿的距離作為炭末在小腸中推進距離。碳末推進率=碳末在小腸中的推進距離/小腸總長度×100%。收集各組大鼠24 h糞便，稱量各組大鼠糞便的濕質量及干質量[先稱量糞便濕質量(

m

)，然后將糞便放入烘干箱烘干后再次稱量糞便干質量(

m

)]，糞便含水量=(

m

-

m

)/

m

×100%。

2.4 結腸組織病理學觀察 收集各組剩余5只大鼠的結腸組織，用4%多聚甲醛固定，將固定組織經脫水、包埋、切片(厚度5 μm)，用蘇木精-伊紅染色，二甲苯透明，中性樹膠封固、光學顯微鏡下觀察。

2.5 MTL、GAS、SP、COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-α含量檢測 按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測大鼠結腸組織MTL、GAS、SP、COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

2.6 AQP3、NF-κB p65 mRNA表達水平檢測 按照TRIzol試劑盒說明書從結腸組織中提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，用Takara TB GreenPreMix Ex Taq測定基因表達水平。引物序列：

AQP3：5′-GGTTCCATCGCTGGTGTCTTCG TGTA-3′(正向)，5′-CCGAGAGAGGCATCACAAAGGGCTTT-3′(反向)；

NF-κB p65：5′-GCCAGCACCAAGACCGAAG CAATT-3′(正向)，5′-TACCGCCAGCAGCATCTTCACATCTC-3′(反向)；

GADPH：5′-ATCCCATCACCATCTTCCCA G-3′(正向)，5′-CCATCACGCCAGTTTTCC-3′(反向)。

以GAPDH內參。qRT-PCR反應條件：95 ℃初始變性10 min，隨后95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，45個循環，記錄

C

值，采用2-ΔΔ法分析相對表達水平。

2.7 AQP3、CFTR、PKA、p-NF-κB p65、IκBα蛋白表達水平檢測 取大鼠結腸組織，加入蛋白裂解液提取蛋白，冰上孵育離心后，收集上清液，用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。后將上清液與SDS-PAGE樣品加載緩沖液混合，并轉移到PVDF膜上，在5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h后，將膜與抗AQP3、CFTR、PKA、p-NF-κB p65、IκBα(均1∶500)或β-actin(1∶2 500)的一抗在4 ℃孵育過夜，隨后與二級抗體(1∶3 000)室溫孵育1 h，使用化學發光檢測試劑盒暗室顯色，顯色后的蛋白使用Bio-Rad全功能成像系統采集圖像，Image-Pro Plus分析光密度，以β-actin為內參，對照組目標蛋白質相對含量為1，計算各組蛋白質的相對表達量，實驗重復3次。

3 結果

3.1 電針神闕穴對功能性便秘大鼠糞便粒數、糞便含水量及炭末推進率的影響 大鼠在整個實驗過程中均未死亡。與空白組比較，模型組大鼠糞便粒數、糞便含水量及炭末推進率均明顯減少(

P

<0

.

05)；與模型組比較，蓯蓉通便口服液組和電針治療組大鼠糞便粒數、糞便含水量及炭末推進率均明顯升高(

P

<0

.

05)。見表1。

表1 各組大鼠糞便粒數(n=10)、糞便含水量(n=10)及炭末推進率(n=5)比較

3.2 電針神闕穴對功能性便秘大鼠組織病理學的影響 空白組大鼠結腸組織未見明顯病理變化。模型組大鼠結腸組織結構被破壞，黏膜層壞死較為明顯，上皮基本脫落后缺失，固有層腸腺結構模糊，杯狀細胞較少或基本不見，壞死區域及腸腔內可見壞死細胞碎片。蓯蓉通便口服液組大鼠局部結腸組織結構被破壞，黏膜淺表變性壞死，見上皮壞死脫落，固有層內少量腸腺溶解壞死，壞死區域染色較淺，結構模糊。電針治療組大鼠局部結腸組織結構被破壞，部分區域黏膜壞死，上皮缺失，固有層內少量腸腺結構模糊。見圖1。

圖1 各組大鼠結腸組織病理學變化(蘇木精-伊紅染色)

3.3 電針神闕穴對功能性便秘大鼠結腸MTL、GAS、SP含量的影響 與空白組比較，模型組大鼠結腸組織MTL、GAS、SP含量均明顯降低(

P

<0

.

05)；與模型組比較，蓯蓉通便口服液組和電針治療組大鼠結腸組織MTL、GAS、SP含量均明顯升高(

P

<0

.

05)。見表2。

表2 各組大鼠結腸運動指數功能比較

3.4 電針神闕穴對功能性便秘大鼠炎癥因子水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠結腸組織COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-α含量均明顯升高(

P

<0

.

05)；與模型組比較，蓯蓉通便口服液組和電針治療組大鼠結腸組織COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-α含量均明顯降低(

P

<0

.

05)。見表3。

表3 各組大鼠炎癥細胞因子水平比較

3.5 電針神闕穴對功能性便秘大鼠AQP3和NF-κB信號通路的影響 與空白組比較，模型組大鼠結腸組織AQP3 mRNA及其蛋白表達水平，CFTR、PKA、IκBα蛋白表達水平均明顯降低(

P

<0

.

05)，NF-κB p65 mRNA表達水平及p-NF-κB p65蛋白表達水平均明顯升高(

P

<0

.

05)；與模型組比較，蓯蓉通便口服液組和電針治療組大鼠結腸組織AQP3、CFTR、PKA、IκBα蛋白表達水平明顯升高(

P

<0

.

05)，NF-κB p65 mRNA表達水平明顯降低(

P

<0

.

05)，電針治療組AQP3 mRNA表達水平明顯升高(

P

<0

.

05)，而蓯蓉通便口服液組AQP3 mRNA表達水平無明顯變化(

P

>0

.

05)。見圖2、圖3、圖4。

圖2 Western blot法檢測各組結腸組織AQP3、CFTR、PKA、p-NF-κB p65、IκBα蛋白表達水平

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

功能性便秘嚴重者可能導致躁動、嘔吐、腸梗阻、穿孔，并可能與致命的肺栓塞或吸入有關。目前，20%～30%的60歲以上老年人每周需使用一種以上的瀉藥，含有番瀉苷或氧化鎂的藥物有很強的通便活性，然而這些藥物會產生不良反應，頻繁使用可誘發結腸黑變病，這是結腸腫瘤的危險因素。研究顯示，俞募配穴電針對功能性腸病具有雙向調節作用。然而有關電針神闕穴對功能性便秘作用的報道較少。因此，本研究觀察了電針神闕穴對功能性便秘大鼠組織病理學、結腸運動指數、炎癥因子、AQP3和NF-κB信號通路的影響，以探討電針神闕穴治療功能性便秘的作用機制。

功能性便秘發病機制尚不十分清楚，可能與結腸動力改變、直腸功能障礙、胃腸神經分泌異常等因素有關，而這些因素不僅導致功能性便秘患者胃腸功能障礙，也會誘發全身性炎癥免疫反應。孫偉義等報道，采用黃芪、肉蓯蓉等清熱解毒通腑湯灌腸可有效降低功能性便秘機械通氣伴胃腸功能障礙患者IL-6、TNF-α含量，改善胃腸功能。在本研究中，模型組大鼠糞便粒數、糞便含水量、炭末推進率及結腸組織MTL、GAS、SP含量明顯低于空白組，且結腸組織結構被破壞，黏膜層壞死較明顯，而結腸組織COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯高于空白組，提示胃腸激素及炎癥因子可能參與功能性便秘的進展。蓯蓉通便口服液組和電針治療組大鼠糞便粒數、糞便含水量、炭末推進率及結腸組織MTL、GAS、SP含量明顯升高，結腸組織COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯降低，結腸炎癥細胞浸潤減少，可見電針神闕穴可以有效延緩結腸組織病變程度。研究顯示，蓯蓉通便口服液具有滋陰補腎、潤腸通便、調節免疫、抗氧化、抗衰老及抗疲勞等功能，已被應用于便秘的治療。本研究應用蓯蓉通便口服液作為陽性對照，發現電針神闕穴與蓯蓉通便口服液具有同等的調節作用。

有報道顯示，AQP1—AQP4和AQP8在動物結腸黏膜上皮細胞中表達，且便秘的發病機制與結腸AQP的異常密切相關。Chao等證實AQP的異常表達可以影響結腸水代謝和腸道通透性的改變。本研究結果顯示，電針神闕穴可明顯升高結腸組織AQP3 mRNA和蛋白的表達水平，提示電針神闕穴上調結腸組織AQP3表達。環磷酸腺苷反應原件結合蛋白(cyclic adenosine monophosphate response element binding protein，CREB)的磷酸化是由PKA、絲裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶C和鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶等蛋白激酶介導的，CREB的磷酸化可以促進AQP3的轉錄和表達。CFTR氯通道是驅動腸液分泌的主要途徑，在維持管腔內容物的潤滑中起重要作用。Harada等研究表明，麻仁丸可通過激活CFTR氯通道改善阿片類藥物誘導的便秘。本研究結果顯示，蓯蓉通便口服液、電針神闕穴可上調PKA、CFTR的蛋白表達水平，與AQP3的上調趨勢一致，可能共同起到治療便秘的作用。

有研究結果顯示，抑制NF-κB信號通路的激活可進一步促進AQP3的表達，NF-κB信號的激活對AQP2通道的下調非常重要。此外，IκBα與NF-κB結合組成NF-κB/IκBα復合體，以無活性的形式存在于細胞質中，激活的IKKβ靶向IκBα蛋白的絲氨酸殘基，促使IκBα發生泛素化、磷酸化反應或降解，使得NF-κB游離并活化，游離的NF-κB能夠調控IL-6、TNF-α等，進而加速疾病的進展。本研究結果發現，蓯蓉通便口服液、電針神闕穴明顯降低大鼠結腸組織NF-κB p65的表達水平，增加AQP3的表達水平，提示電針神闕穴增加AQP3的作用可能是通過下調NF-κB信號通路實現的。

綜上所述，電針神闕穴可改善功能性便秘大鼠糞便含水量和腸道轉運速率，改善結腸組織病理變化，其機制可能與調節AQP3、NF-κB信號通路有關。