BTG2對非小細胞肺癌放療敏感性的影響及其機制

鄭 藝,胡 芃,張洪波,吳愛林,康亞輝,詹必紅

(中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院西區(qū),安徽省腫瘤醫(yī)院腫瘤放射治療科,合肥 230001;*通訊作者,E-mail:534116872@qq.com)

肺癌是目前全世界具有較高發(fā)病率和死亡率且對人群健康和生命產生重大威脅的惡性腫瘤之一,而其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占據(jù)了80%-85%[1,2]。NSCLC早期癥狀不明顯,一經診斷,70%左右患者已經進入中晚期,失去了手術根治的機會。目前針對中晚期NSCLC,放射治療或化放療聯(lián)合治療是其主要治療手段,但其總體預后較差,5年生存率較差[3]。同時高劑量的放射治療有可能給患者帶來較嚴重的并發(fā)癥,且某些類型的肺癌細胞對放療的敏感性較低甚至出現(xiàn)放射抵抗,從而使放療的作用大大降低。因此,研究如何增加NSCLC的放射治療效應在臨床上有著重要意義。B細胞易位基因2(B cell translocation gene 2,BTG2)是抗增殖基因家族的一個瞬時早期反應基因,在多種組織和器官中均有表達,是公認的腫瘤抑制基因,同時也是DNA損傷細胞反應通路中p53依賴性的成分之一[4,5]。放療射線對細胞的損傷可通過直接作用于DNA分子,導致DNA鏈斷裂[6],目前BTG2對NSCLC放療敏感性影響的研究很少。本研究通過分析數(shù)據(jù)庫中臨床NSCLC患者腫瘤樣本中BTG2的表達情況,分析BTG2表達水平與患者預后的相關性,探討B(tài)TG2對NSCLC放療敏感性的影響及其可能機制,為NSCLC的放射治療相關靶基因的研究提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

噻唑藍(5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)購自美國Sigma公司。攜帶無意義序列的陰性對照質粒pcDNA3.1-HA和攜帶BTG2的HA-BTG2質粒購自通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司。LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司。BTG2(ab197362)、P53(ab32389)、BRCA1(ab238983)蛋白抗體購自英國Abcam公司,GAPDH(AP0066)抗體購自南京巴傲德生物科技有限公司。

1.2 數(shù)據(jù)庫查詢BTG2在NSCLC中的表達情況

通過使用Oncomine和TCGA數(shù)據(jù)庫,查詢BTG2蛋白在不同腫瘤中的表達水平,同時分析統(tǒng)計BTG2蛋白在腫瘤組織和正常組織中的表達水平。通過TIMER:Tumor IMmune Estimation Resource數(shù)據(jù)庫和Kaplan-Meier Plotter的分析方法對BTG2水平與NSCLC患者術后生存率關系進行研究。

1.3 細胞株、細胞培養(yǎng)和細胞分組

人肺腺癌細胞系H1975和人正常肺上皮細胞系BEAS-2B購自上海細胞庫,胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。兩株細胞在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,37 ℃且含有5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在檢測BTG2對H1975細胞增殖及對放射敏感性時,H1975細胞分為:對照組(轉染pcDNA3.1-HA空載質粒)和過表達組(轉染HA-BTG2質粒)。在探尋BTG2增強H1975細胞放療敏感性的可能機制時,H1975細胞分為:對照組(轉染pcDNA3.1-HA空載質粒)、過表達組(轉染HA-BTG2質粒)、照射組(轉染pc-DNA3.1-HA空載質粒+X射線4 Gy照射)和聯(lián)合組(轉染HA-BTG2質粒+X射線4 Gy照射)。

1.4 細胞轉染

轉染前1 d,將胰酶消化后的H1975細胞按照每孔1×105個細胞在6孔板中進行鋪板,當細胞密度達到約80%時開始轉染。對于每孔細胞,使用200 μl無血清培養(yǎng)基稀釋2 μg質粒DNA,混勻,靜置5 min;使用200 μl無血清培養(yǎng)基稀釋4 μl LipofectamineTM3000轉染試劑,混勻,靜置5 min;將稀釋的DNA和稀釋的轉染試劑輕輕混勻,室溫孵育20 min。6孔板中棄去培養(yǎng)基,加入1.6 ml的只含有10%血清的培養(yǎng)基和DNA-轉染試劑復合物,輕搖培養(yǎng)板使其混勻,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24-48 h。

1.5 MTT實驗檢測細胞增殖能力

取對數(shù)生長期的H1975細胞制成終濃度為7.5×104/ml的單細胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)板,100 μl/孔,37 ℃,5% CO2,在飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)24 h。分別轉染pcDNA3.1-HA和HA-BTG2質粒,繼續(xù)培養(yǎng)24,48,72,96 h,加入15 μl的MTT溶液(5 mg/ml)。4 h后仔細地吸去上清,每孔加入150 μl二甲基亞砜(dimethylsulphoxide,DMSO),震蕩器震蕩待甲臜完全溶解,30 min后在490 nm波長處用酶聯(lián)免疫檢測儀測吸光度值(OD490)。重復3次取平均值。檢測BTG2對放療的增敏作用時,細胞在完成轉染24 h后分別采用不同劑量X射線(0,1,2,4,8 Gy)照射一次,并繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,按上述操作通過MTT實驗來檢測細胞的增殖活性。

1.6 Western blot檢測BTG2、P53和BRCA1蛋白表達變化

將經過處理后的細胞轉移至1.5 ml離心管中,1 500 r/min離心5 min,棄上清,加入適量細胞裂解液,冰上裂解30 min,12 000 r/min離心10 min獲得蛋白樣品。BCA法檢測各組蛋白樣品濃度,各組上樣體積為30 μg,進行SDS-PAGE凝膠電泳,轉膜,牛奶封閉1 h后TBST清洗3次,6 min/次;一抗(BTG2,1 ∶1 000;P53,1 ∶1 000;BRCA1,1 ∶1 500;GAPDH,1 ∶5 000)過夜低溫孵育;二抗(Goat anti-Rabbit IgG H & L-HRP;1 ∶50 000)室溫孵育1 h,ECL化學發(fā)光法置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照,并通過Image J軟件進行灰度值掃描分析。

1.7 統(tǒng)計學分析

所有實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析,數(shù)據(jù)描述用平均數(shù)±標準差表示,兩組間差異比較采用獨立t檢驗,多組間采用單因素方差分析(one-way ANOVA),兩兩比較采用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BTG2在非小細胞肺癌中的表達譜分析

Tumor IMmune Estimation Resource、Oncomine和TCGA數(shù)據(jù)庫結果表明BTG2在NSCLC中mRNA的表達量較正常組織中明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖1)。

圖1 不同數(shù)據(jù)庫分析BTG2在癌旁組織和肺癌組織中的表達量Figure 1 Expression of BTG2 in adjacent tissues and NSCLC tissues in various databases

2.2 BTG2基因蛋白表達與非小細胞肺癌患者預后的關系

數(shù)據(jù)庫分析結果表明BTG2低表達的NSCLC患者總體生存時間要低于BTG2高表達的患者(P<0.05,見圖2)。

A.TIMER數(shù)據(jù)庫中NSCLS患者生存率比較B.Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中NSCLS患者生存率比較圖2 NSCLC患者BTG2高表達與低表達組生存率的比較Figure 2 Comparison of survival rate in NSCLC patients between BTG2 high expression group and BTG2 low expression group

2.3 BTG2對非小細胞肺癌細胞增殖的影響

Western blot實驗結果顯示,與人正常肺上皮細胞系BEAS-2B相比,人肺腺癌細胞系H1975中BTG2的表達明顯降低(P<0.05,見圖3)。H1975細胞中過表達HA-BTG2質粒構建成功(見圖4)。MTT結果顯示,H1975細胞中過表達BTG2抑制了NSCLC細胞的增殖,在培養(yǎng)48,72,96 h時各過表達組與對照組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖5)。表明過表達BTG2可以顯著抑制NSCLC細胞H1975的增殖能力。

與BEAS-2B細胞相比,***P<0.001圖3 BTG2在BEAS-2B和H1975細胞中的表達情況Figure 3 Expression of BTG2 in BEAS-2B and H1975 cells

與對照組相比,***P<0.001圖4 H1975細胞中過表達HA-BTG2后驗證BTG2的表達Figure 4 Verification of BTG2 expression in H1975 cells after the overexpression of HA-BTG2

與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01圖5 過表達HA-BTG2對H1975細胞增殖的影響Figure 5 Effects of BTG2 on the proliferation of NSCLC cell

2.4 BTG2對非小細胞肺癌細胞的放療增敏作用

MTT結果顯示,與對照組相比較,在經過不同劑量X射線照射后,過表達組H1975細胞的增殖活性明顯減弱。當照射劑量為4 Gy時,對照組和過表達組H1975細胞的OD值分別為0.85±0.03和0.64±0.05,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖6)。

與對照組相比,**P<0.01,***P<0.001圖6 BTG2過表達對NSCLC細胞放射治療后增殖的影響Figure 6 Effects of BTG2 overexpression on the proliferation of NSCLC cells after radiotherapy

表明BTG2對NSCLC細胞具有放療增敏作用。

2.5 BTG2通過調控NSCLC細胞DNA損傷修復作用增強放療敏感性

Western blot結果顯示,與對照組相比,過表達組P53蛋白表達增加,BRCA1蛋白表達降低(P<0.05);照射組BRCA1蛋白表達較對照組降低(P<0.05)，而對P53幾乎無影響(P>0.05)。與照射組和過表達組相比,聯(lián)合組H1975細胞中P53蛋白表達明顯升高,BRCA1蛋白表達降低,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖7)。

與對照組比較，**P<0.01；與照射組相比,###P<0.001圖7 BTG2和X射線聯(lián)用對H1975細胞中P53和BRCA1蛋白表達的影響Figure 7 Effects of BTG2 and X-ray exposure on the expression of P53 and BRCA1 proteins in H1975 cells

3 討論

近年來,肺癌成為我國發(fā)生率和死亡率第一位的惡性腫瘤,其中約85%的患者為NSCLC,目前NSCLC的治療手段主要包括手術治療、化療和放射治療,但大多數(shù)NSCLC患者在確診時就已經失去了手術的機會,因此放射治療在NSCLC治療中尤為重要,尤其是中晚期患者[7,8]。在這個過程中,NSCLC患者通常會伴有不同程度的放療不敏感即放療抵抗,極大程度地限制了腫瘤放射治療的效果[9]。放療抵抗的產生是一個多基因、多因子和多機制共同參與的過程。放療射線對腫瘤細胞的損傷作用分為兩種:一種是直接損傷,射線直接作用在DNA分子上使其DNA單鏈或雙鏈的斷裂交叉;另一種是間接損傷,射線能夠對患者人體組織內的水產生電離作用從而產生毒性自由基,繼而對DNA等生物大分子發(fā)揮作用給腫瘤細胞帶來不可逆的損傷[10]。因此,在NSCLC治療過程中增強患者對放療的敏感性有著重要的臨床意義。

BTG/TOB基因家族是新發(fā)現(xiàn)的一個抗增殖基因家族,被發(fā)現(xiàn)在促進細胞分化、抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡和調控基因表達等方面都扮演著重要角色[5]。BTG2作為該家族第一個被發(fā)現(xiàn)的基因,大量研究表明,BTG2在多種組織和器官中均有表達,參與了細胞增殖分化、細胞周期調控、DNA損傷修復等多種生物學活動[11]。近期大量研究報道BTG2在腫瘤中的表達水平與腫瘤的生物學特性緊密相關,被認為是腫瘤抑制基因,在肝癌[12]、膀胱癌[13]、乳腺癌[14]、卵巢癌[15]等腫瘤中呈表達顯著減少甚至不表達的現(xiàn)象,并且影響腫瘤患者的生存質量和預后情況。Zhang等[16]報道,當細胞受到刺激因子作用繼而發(fā)生應激反應時,BTG2會通過抑制Cyclin D1的轉錄從而降低其蛋白水平,誘導細胞在G1/S期停滯,起到抑制腫瘤細胞增殖的作用。同時,BTG2結構中從-74到-122區(qū)域存在著野生型p53基因反應元件,Cortes等[17]研究發(fā)現(xiàn),細胞在受到紫外線照射后,出現(xiàn)DNA損傷,P53蛋白表達顯著增加的同時伴隨著BTG2蛋白表達上調,表明BTG2在射線導致的DNA損傷修復過程中可能發(fā)揮重要作用。毛必靜等[18]在肝癌中發(fā)現(xiàn)P53可以直接上調BTG2的表達,且能夠抑制Cyclin D1和Cyclin E的蛋白表達。在DNA處于受損狀態(tài)時,P53蛋白上調,使得細胞周期阻滯在G1/S期,DNA開始修復損傷。在此過程中,BTG2可以通過增加DNA損傷關鍵蛋白MRE11的甲基化和蛋白精氨酸甲基轉移酶PRMTs的活性來加速DNA的修復過程。DNA的損傷修復是腫瘤細胞產生放射抵抗的重要原因之一,腫瘤細胞對于電離輻射的敏感性在很大程度上取決于DNA鏈斷裂程度及其自身的損傷修復能力。DNA損傷修復機制主要包括同源重組和非同源末端連接,而BRCA1蛋白直接參與這兩個過程,其表達下調能夠減少斷裂DNA雙鏈的修復并誘導NSCLC細胞凋亡[19]。研究表明BTG2和BRCA1兩種蛋白可以形成蛋白-蛋白復合物,以負反饋調控的形式來共同調節(jié)DNA的損傷修復過程[20]。目前已有研究[20]發(fā)現(xiàn)各種DNA損傷如UV照射和電離輻射照射等刺激后都可以直接誘導BTG2的表達和功能活化,以上結果均表明BTG2可以增強腫瘤細胞對放療的敏感性,但目前BTG2在NSCLC放療過程中的作用和機制尚無報道。

本實驗研究中,我們通過查閱多種數(shù)據(jù)庫[21,22]并進行分析發(fā)現(xiàn),BTG2在肺癌的腫瘤組織中的表達顯著低于癌旁組織,且BTG2低表達時腫瘤患者的預后較差。同樣,NSCLC細胞中BTG2的表達顯著低于正常肺上皮細胞中BTG2表達。MTT實驗結果表明過表達BTG2可以顯著抑制NSCLC細胞H1975的增殖能力,且能明顯增強H1975細胞對于X射線的放療敏感性。與照射組相比,聯(lián)合組能夠在進一步上調P53表達的同時下調BRCA1的表達。綜上所述,BTG2在NSCLC中可能是通過上調P53的表達、降低BRCA1的表達來干擾DNA的損傷修復過程,進而抑制NSCLC細胞的增殖,為臨床NSCLC的治療提供參考。