合并肝細胞性肝癌的細粒棘球蚴感染裸鼠移植瘤中NK細胞的表達

艾麥提·牙森,熱則耶·熱合曼,下依馬旦·節里力,王 恒,朱馬圖迪·朱馬洪,阿力木江·吐拉麥提,王茂林,冉 博*

(1新疆醫科大學第一附屬醫院消化血管外科中心肝膽包蟲病外科,烏魯木齊 830054;2新疆維吾爾自治區包蟲及肝膽疾病臨床醫學研究中心;3新疆醫科大學第一臨床醫學院;*通訊作者,E-mail:ranbo822116@163.com)

棘球蚴病是一種棘球蚴絳蟲的蟲卵感染所致的,呈世界性分布的的人畜共患疾病,嚴重危害全球衛生和經濟發展,尤其在中國西部和南美洲的牧區最為嚴重[1]。流行病學調查發現,病原微生物包括細菌、真菌和寄生蟲感染,也與惡性腫瘤的發生發展密切相關[2,3],目前約有200萬惡性腫瘤病例是由病原微生物感染引起的,占全世界惡性腫瘤發生率的16.1%[4]。

研究表明,病原微生物與惡性腫瘤所產生的抗原,如O-糖基化抗原、Tn抗原和arc5抗原等具有許多相似性,這些共同抗原的表達為棘球蚴病與惡性腫瘤的研究提供基礎[5,6]。此外,實驗證明,給荷瘤動物模型注射寄生蟲抗原后,相關免疫系統功能增強、免疫細胞數量增加[7],提示寄生蟲感染合并惡性腫瘤可影響宿主免疫細胞功能狀態。Noya等[8]研究結果提示,肝囊型棘球蚴病患者囊液中所獲取的mucin-like肽具有提高宿主NK細胞數量從而影響惡性腫瘤發生發展的作用。目前關于NK細胞在肝細胞性肝癌合并細粒棘球蚴(Echinococcus granulosus, Eg)感染移植瘤中作用相關的研究甚少。故本研究通過HepG2細胞單獨接種和/或與Eg的原頭蚴(protoscolices, PSCs)聯合接種建立裸鼠皮下移植瘤模型檢測NK細胞標志物的表達情況,初步探討NK細胞在肝細胞性肝癌合并Eg感染裸鼠移植瘤的作用,為寄生蟲合并惡性腫瘤的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2人肝細胞性肝癌細胞系購自北京北納創聯生物技術公司BNCC細胞庫;Eg PSCs來自于新疆烏魯木齊華凌屠宰場中自然感染細粒棘球蚴的綿羊肝臟,并在無菌條件下獲得。

1.2 主要試劑

DMEM培養基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素購自美國Gibco公司;CD16兔單克隆抗體、CD56兔多克隆抗體、NKG2D兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗及DAB顯色液購自英國Abcam公司;生理鹽水、PBS緩沖液、山羊血清封閉液、檸檬酸鈉抗原修復液及中性樹膠購自中國中杉金橋生物技術有限公司;Trizole、RNA逆轉錄試劑盒、SYBR購自大連TaKaRa公司。

1.3 Eg PSCs的收集

在無菌條件下檢查囊腫,抽吸原頭節。2 000 r/min離心2 min后棄上清。加入10 ml生理鹽水清洗3次(按上述條件離心),以10%胎牛血清+DMEM培養基培養Eg PSCs。

1.4 HepG2細胞培養

以10%胎牛血清+1%雙抗(青霉素-鏈霉素)+DMEM培養基培養細胞,置于含5%CO2的37 ℃培養箱中培養,1-2 d換液,2-3 d細胞傳代。

1.5 Eg感染合并肝細胞性肝癌的裸鼠移植瘤模型建立

選取40只8-10周齡雌性BALB/c裸鼠,體質量(15±3)g,將其隨機分為單獨移植組和聯合移植組。單獨移植組將5×106個HepG2細胞接種于裸鼠皮下;聯合移植組將5×106個HepG2細胞和2 000個Eg PSCs聯合接種于裸鼠皮下。觀察兩組裸鼠的飲食、活動反應及精神狀態,對外界刺激的反應。其中,腫瘤體積(V)的測量:自接種后第25天起,每4 d用游標卡尺測量皮下移植瘤的長徑(a)和短徑(b),共測量5次(即接種第25,28,31,34,37天),按公式V=ab2/2計算移植瘤體積。接種37 d獲取皮下移植瘤,將一半組織經脫水石蠟包埋用于病理染色,另一半組織凍存于-80 ℃冰箱用于qRT-PCR實驗。

1.6 蘇木素伊紅(HE)染色觀察移植瘤的基本病理變化

將薄片放入62 ℃烤箱烤烘60 min后常規脫蠟,放入蒸餾水浸洗3次×5 min,隨后浸泡蘇木素溶液1.5-2 min,立即蒸餾水沖洗至泛色,用鹽酸乙醇分化2-5 s,再放入蒸餾水反藍40-60 s后浸泡伊紅溶液1-1.5 min,蒸餾水反復沖洗至泛色,常規脫水,透明并晾干,中性樹膠封片后光學顯微鏡下觀察并收集圖像。

1.7 免疫組織化學染色檢測NK細胞相關蛋白在移植瘤中的表達

將薄片放入62 ℃烤箱烤烘60 min后常規脫蠟,用蒸餾水沖洗3次×5 min,泡在枸櫞酸抗原修復液高溫(90-100 ℃)修復15 min,自然冷卻至室溫。PBS緩沖液沖洗3次×5 min,置于3% H2O2溶液室溫孵育10 min,PBS緩沖液沖洗3次×5 min,滴加山羊血清室溫封閉1 h后滴加一抗(CD16 1 ∶200;CD56 1 ∶100;NKG2D 1 ∶400)置于4 ℃冰箱孵育過夜。次日復溫1 h后,PBS緩沖液洗3次×5 min,滴加二抗(1 ∶2 000)室溫孵育90 min;PBS緩沖溶液沖洗3次×5 min后滴加適量DAB顯色液于光學顯微鏡下觀察顯色。蘇木精復染10-30 s,反復沖洗至泛色,浸泡鹽酸乙醇分化2-3 s后,用蒸餾水反藍40-60 s。最后常規脫水、透明、自然晾干后封固。顯微鏡下觀察并采圖,使用ImageJ軟件計算陽性區域面積,然后進行統計分析。

1.8 qRT-PCR檢測NK細胞相關mRNA在移植瘤中的表達

用Trizole試劑提取裸鼠皮下移植瘤中的總mRNA。按照反轉錄試劑盒說明書操作反轉錄為cDNA,反轉錄條件:25 ℃ 10 min,42 ℃ 50 min,85 ℃ 5 min。按照熒光定量PCR擴增試劑盒說明書操作,擴增條件設置:94 ℃預變性4 min,94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循環40次,72 ℃檢測信號。使用2-ΔΔCt法來計算相對mRNA含量,ΔCt=Ct目的基因-Ct管家基因GAPDH,ΔΔCt=ΔCt聯合移植組-ΔCt單獨移植組,2-ΔΔCt表示聯合移植組目的基因mRNA的相對含量較單獨移植組所改變的倍數。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.9 統計分析

2 結果

2.1 皮下移植瘤的大體變化

自接種后第25天起,每4 d測量皮下移植瘤體積,共5次。結果顯示,與單獨移植組相比,聯合移植組不同接種時間移植瘤的體積明顯增大,差異具有統計學意義(P<0.05,見圖1),表明Eg感染對HepG2細胞體內的增殖有促進作用。

圖1 皮下移植瘤體積的變化Figure 1 Changes of volume of subcutaneous lesions

2.2 皮下移植瘤的基本病理變化

HE染色顯示,HepG2細胞單獨移植組細胞形態和體積不均一,細胞質嗜堿,核質比例增加,有絲分裂活性增強。此外,部分細胞出現脂肪變性、凝固性壞死和空泡。Eg PSCs和HepG2細胞聯合移植組中細胞病理變化更為明顯,并可見典型的Eg PSCs結構(見圖2)。

黑色箭頭表示脂肪變性,藍色箭頭表示空泡樣變化,黃色箭頭表示凝固性壞死,紅色箭頭表示Eg PSCs結構圖2 皮下移植瘤的基本病理變化Figure 2 Basic pathological changes of subcutaneous lesions

2.3 CD16陽性NK細胞在皮下移植瘤中的表達

免疫組織化學染色結果顯示,CD16陽性NK細胞主要定位于皮下移植瘤組織,呈棕褐色。定量結果顯示,Eg PSCs和HepG2細胞聯合移植組CD16陽性NK細胞的表達量明顯高于HepG2細胞單獨移植組,差異具有統計學意義(P<0.05)。qRT-PCR結果顯示,聯合移植組中CD16 mRNA表達量較單獨移植組明顯增加,差異具有統計學意義(P<0.05,見圖3)。

2.4 CD56陽性NK細胞在皮下移植瘤中的表達

免疫組織化學染色結果顯示,CD56陽性NK細胞主要定位于皮下移植瘤組織,呈棕褐色。定量結果顯示,Eg PSCs和HepG2細胞聯合移植組CD56陽性NK細胞的表達量明顯高于HepG2細胞單獨移植組,差異具有統計學意義(P<0.05)。qRT-PCR結果顯示,聯合移植組中CD56 mRNA表達量較單獨移植組明顯增加,差異具有統計學意義(P<0.05,見圖4)。

箭頭表示CD16陽性NK細胞;與單獨移植組(HepG2)相比,*P<0.05圖3 CD16陽性NK細胞在皮下移植瘤中的表達 (×200)Figure 3 Expression of CD16 positive NK cells in the subcutaneous lesions (×200)

箭頭表示CD56陽性NK細胞;與單獨移植組(HepG2)相比,*P<0.05圖4 CD56陽性NK細胞在皮下移植瘤中的表達 (×200)Figure 4 Expression of CD56 positive NK cells in the subcutaneous lesions (×200)

2.5 NKG2D在皮下移植瘤中的表達

免疫組織化學染色結果顯示,NK細胞分泌的NKG2D主要定位于皮下移植瘤組織,呈棕褐色。定量結果顯示,Eg PSCs和HepG2細胞聯合移植組NKG2D陽性細胞的表達量明顯高于HepG2細胞單獨移植組,差異具有統計學意義(P<0.05)。qRT-PCR結果顯示,聯合移植組中NKG2D mRNA表達量較單獨移植組明顯增加,差異具有統計學意義(P<0.05,見圖5)。

箭頭表示NKG2D陽性細胞;與單獨移植組(HepG2)相比,*P<0.05圖5 NKG2D在皮下移植瘤中的表達 (×200)Figure 5 NKG2D expression in the subcutaneous lesions (×200)

3 討論

寄生蟲感染與惡性腫瘤之間存在密切的關系。寄生蟲感染后隨著血流到達全身各個部位寄生,導致宿主免疫力下降從而引起各種疾病的發生。此外,寄生蟲感染所產生的代謝產物或分泌的細胞因子和生長因子對宿主微環境產生細胞毒素作用,并誘導某些類型惡性腫瘤發生[9,10]。相反,在惡性腫瘤發生發展過程中,腫瘤特異性抗原在體內被降解為小片段,通過影響宿主免疫系統和免疫細胞功能狀態從而引起各種感染性疾病的發生[11,12]。在臨床工作中寄生蟲感染合并惡性腫瘤患者十分罕見,但由于缺乏典型的臨床表現和特征,大多數患者未及時發現并到中晚期才尋求治療,對這些患者來說手術和藥物治療效果均較差。因此,開展寄生蟲感染合并惡性腫瘤發生相關的研究顯得尤為重要。

研究表明,與肝惡性腫瘤患者相比(中位生存時間6個月),囊型棘球蚴病合并肝惡性腫瘤患者生存時間明顯延長(中位生存時間17個月),提示Eg感染與肝惡性腫瘤的發生發展之間存在明確的相關性[13]。此外,體外采用Eg PSCs和HepG2細胞共培養發現,Eg PSCs能促進HepG2細胞的增殖、侵襲和遷移能力,這可能與Eg PSCs分泌一些細胞因子有關[14]。Eg侵入中間宿主后引起機體免疫系統發生一些變化從而逐漸形成病理性的免疫逃避機制。其中,NK細胞作為重要的固有免疫細胞參與T細胞特異性免疫反應的過程,引起Eg病灶微環境免疫狀態的改變[15,16]。此外,囊液中的分泌物通過改變宿主NK細胞數量和功能狀態對惡性腫瘤的發生發展具有促進作用。由于體外共培養實驗體系未考慮到免疫系統的作用,因此需要開展動物實驗進一步探討Eg感染對肝惡性腫瘤的影響以及闡明宿主免疫細胞的功能狀態。

本實驗中采用Eg PSCs和HepG2細胞系建立裸鼠皮下移植瘤模型,結果顯示,在聯合移植組中皮下移植瘤體積較單獨移植組明顯增大,提示Eg感染在體內促進HepG2細胞的增殖,這與近期體外實驗結果一致[17]。研究表明,寄生蟲感染和惡性腫瘤生長過程中,通過高表達免疫抑制性NKG2A導致NK細胞功能的耗竭和機體免疫耐受,從而影響疾病的轉歸[18,19]。我們免疫組織化學染色和qRT-pCR結果顯示,與單獨HepG2細胞移植組相比,在聯合移植組中CD16、CD56、NKG2D等NK細胞標志物表達量明顯增加,表明Eg感染后NK細胞可能通過高表達免疫抑制性分子處于免疫耗竭的狀態從而促進HepG2細胞體內的增殖。

總之,NK細胞作為重要的固有免疫細胞可能參與Eg感染引起的HepG2細胞增殖過程。隨著對Eg病灶和腫瘤微環境認識的進一步加深,研究免疫細胞在Eg感染合并惡性腫瘤的作用及其可能的機制具有深遠意義,靶向Eg與惡性腫瘤共同抗原或Eg代謝產物有望成為治療惡性腫瘤的新靶點。