敲低PLK1對脈絡膜黑色素瘤細胞增殖的抑制作用及其機制

趙芃芃,白小芳,盧鳳麗,李思園,譚 叢,蔣勝群,郁 佳,秦 梅

(蚌埠醫學院第一附屬醫院眼科,蚌埠 233000;*通訊作者,E-mail:bbmcqm@163.com)

脈絡膜黑色素瘤(chroidal melanoma,CM)是成人眼內最常見的惡性腫瘤,在全球發病率占眼內惡性腫瘤的首位,惡性程度及致死率均較高,中位生存時間僅為3-5月[1]。目前，CM最主要的兩種治療方法有兩種：手術和放射性敷貼治療。發病早期可造成視力損害，晚期則眼外蔓甚至危及生命[2],但由于發病隱匿，發現時多為晚期，故而早期診斷治療顯得尤為重要。PLK1屬于polo樣激酶家族中的一員,大量研究表明PLK1在人類腫瘤發生發展中具有重要作用,但PLK1在脈絡膜黑色素瘤中的作用國內外尚無研究報道。因此,本研究擬通過分子生物學和表觀遺傳學方法探究PLK1對CM細胞增殖的影響及其可能分子機制,以期為CM的臨床診斷和治療提供新的靶點及思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

RPMI-1640培養基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液購于Gibco生物公司(美國);CCK-8試劑盒、青鏈霉素雙抗溶液、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液、凝聚胺溶液購自睿捷生物(合肥);PLK1抗體購自Abcam公司(美國);BUBR1、GAPDH抗體購于武漢三鷹生物技術公司;組蛋白H3、H3T3ph抗體購于杭州景杰生物公司;RT-qPCR試劑盒購于南京諾唯贊生物公司;細胞周期檢測試劑盒購于南京凱基生物公司;PLK1敲低慢病毒購于上海吉瑪基因生物公司;染色質免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)檢測試劑盒購于碧云天生物公司(上海);所有引物由滁州通用生物公司合成。

1.2 細胞培養

人脈絡膜黑色素瘤C918細胞購于南京凱基生物公司,人脈絡膜血管內皮細胞、人脈絡膜黑色素瘤MuM-2B、MuM-2C細胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司。脈絡膜黑色素瘤細胞復蘇后轉移至含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗溶液的RPMI-1640培養基;脈絡膜血管內皮細胞復蘇后轉移至普諾賽血管內皮細胞專用培養基,置于37 ℃、5% CO2細胞孵箱中常規培養。

1.3 PLK1 shRNA慢病毒感染細胞

為構建PLK1敲低細胞模型,選取對數生長期的C918細胞,消化計數。接種于6孔板中,調整細胞濃度使每孔細胞數量為4×105,細胞培養箱繼續培養24 h進行病毒感染,實驗分為對照組、PLK1敲低組1(sh1組)、PLK1敲低組2(sh2組),即分別加入陰性對照慢病毒(NC組)、PLK1 shRNA1慢病毒、PLK1 shRNA2慢病毒,每孔加入20 μl不同的慢病毒原液和1‰凝聚胺溶液,繼續培養24 h更換新鮮培養基、48 h收集細胞用于后續實驗。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖

為檢測敲低PLK1對C918細胞增殖的影響,按1.3分組及處理,選取慢病毒感染后生長狀態良好的C918細胞,消化計數、調整細胞密度,將其接種至96孔板中,每孔加入100 μl含有2 000個細胞的培養液,每組設置6個復孔。在細胞培養箱中繼續分別培養0,24,48,72 h,每孔加入10 μl CCK-8溶液,培養箱中繼續培養1.5 h,酶標儀檢測各組吸光度OD450值。

1.5 克隆形成實驗檢測細胞增殖

為檢測細胞克隆形成能力,按1.3分組及處理,選取感染后生長狀態良好的C918細胞消化計數、調整細胞密度,將其接種至6孔板中,每孔1 000個細胞,每組設置3個復孔。在細胞培養箱中繼續培養10 d棄去培養基,甲醇室溫固定20 min,結晶紫染色30 min,蒸餾水洗凈烘干,拍照記錄結果。

1.6 細胞周期檢測

為檢測PLK1敲低后對細胞周期的影響,按1.3分組及處理,選取感染后的C918細胞,消化收集細胞,用PBS洗滌一次,調整細胞密度為1×106/ml,取1 ml單細胞懸液,2 000 r/min離心5 min,棄去上清。在細胞中加入體積分數為70%的預冷乙醇500 μl,4 ℃過夜固定。染色前用預冷PBS洗去固定液,加入提前配置好的500 μl染色工作液(臨用前將核糖核酸酶A和碘化丙錠按1 ∶9配制),室溫避光染色50 min,流式細胞儀檢測激發波長488 nm處紅色熒光。所得結果使用Flowjo 7.6軟件進行細胞周期分析。

1.7 RT-qPCR檢測PLK1、BUBR1、DDX11、DDX21、TFDP2、CHEK1、CHEK2基因mRNA表達水平

將按1.3分組及處理后的C918細胞收集于1.5 ml無酶EP管中,加入1 ml Trizol提取RNA,逆轉錄成cDNA。參照南京諾唯贊RT-qPCR試劑盒配制反應體系,上機檢測。反應條件為:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,反應40個循環。引物序列見表1。產物與內參比較,采用2-ΔΔCt相對定量的方式對結果進行計算。

表1 RT-qPCR實驗所使用的引物序列

1.8 Western blot分析PLK1、BUBR1蛋白的表達

將細胞接種于60 mm平皿中(2×105個/孔),培養18-24 h后,按1.3分組及處理,消化收集細胞,用預冷PBS洗2次,2 000 r/min離心10 min后棄去上清液,根據細胞量加入預冷的蛋白裂解液,冰上裂解30 min。4 ℃低溫離心機中12 000g離心30 min提取細胞總蛋白,BCA蛋白定量法測定各組蛋白濃度,調整蛋白濃度,煮樣變性。每組加入30 μg蛋白,SDS-PAGE電泳(70 V 30 min,120 V 70 min);轉膜至PVDF膜;5%脫脂牛奶室溫封閉1 h;一抗(PLK1抗體按1 ∶1 000稀釋、BUBR1抗體按1 ∶2 000稀釋、GAPDH抗體按1 ∶50 000稀釋)4 ℃孵育過夜;PBST洗膜3次,30 min/次;二抗室溫孵育1 h;PBST洗膜3次,30 min/次;ECL發光試劑盒顯影;Bio-Rad凝膠成像系統獲取圖像,收集數據。

1.9 組蛋白提取

為檢測PLK1敲低后對組蛋白H3第3位蘇氨酸磷酸化(H3T11ph)的影響,按1.3分組及處理,收集感染后狀態良好的C918細胞,使用預冷的PBS洗滌2次,棄去上清,加入適量體積的聚乙二醇辛基苯基醚提取緩沖液(triton extraction buffer,TEB)溶液重懸細胞,冰上裂解10 min,6 500g,4℃離心10 min收集細胞核,棄去上清。再用TEB溶液洗滌細胞核,離心,棄去上清。用0.2 mol/L鹽酸重懸細胞核,4 ℃過夜提取。6 500g,4 ℃離心10 min,上清為提取的組蛋白,-20 ℃保存、備用。

1.10 ChIP實驗檢測組蛋白H3T3ph修飾在下游靶基因啟動子上的富集情況

為檢測H3T3ph修飾在靶基因啟動子區域的富集情況,進行ChIP實驗。按照碧云天生物公司ChIP檢測試劑盒說明書進行具體操作,簡述如下。選取細胞生長狀態較好的C918細胞,收集于15 ml離心管中,使用10 ml無血清培養基重懸細胞,加入終濃度1%的甲醛,室溫交聯固定DNA與蛋白復合體10 min,隨后加入終濃度為0.12 mol/L的甘氨酸終止交聯,冰上制備細胞核,然后重懸細胞核并將其轉入新的EP管進行超聲剪切染色質,14 000 r/min,4 ℃離心10 min收集上清,取5 μl上清液作為Input對照組,放入-80 ℃保存備用。另外各取45 μl上清分別加入2 μg IgG抗體(IgG組)和組蛋白H3T3ph修飾抗體(H3T3ph組),且均加入protein G珠子4 ℃搖床過夜。4 ℃離心收集沉淀并洗滌,隨后洗脫免疫沉淀復合物,每個樣加入2 μl蛋白酶K和16 μl的5 mol/L NaCl溶液,65 ℃過夜消化解交聯。最后使用酚氯仿提取DNA用于后續PCR定量實驗。通過比較H3T3ph組的信號強度相比于IgG組信號強度在靶基因啟動子上的富集倍數,進而明確H3T3ph修飾在靶基因啟動子上的結合位置。

1.11 統計學方法

實驗數據均使用SPSS 20.0軟件進行處理分析,數據均以平均數±標準差表示,多組間差異采用單因素方差分析,兩組間差異比較使用t檢驗。P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PLK1在脈絡膜黑色素瘤細胞中高表達

RT-qPCR結果表明:相比于脈絡膜血管內皮細胞,脈絡膜黑色素瘤MuM-2B、MuM-2C、C918細胞的PLK1 mRNA表達顯著升高,且差異具有統計學意義(P<0.05,見圖1A)。Western blot結果證實:相比于脈絡膜內皮細胞,脈絡膜黑色素瘤細胞中PLK1蛋白表達水平上調(見圖1B)。因PLK1在C918細胞中表達量最高,故將C918細胞用于后續實驗。

圖1 PLK1在脈絡膜血管內皮細胞和脈絡膜黑色素瘤細胞中表達情況Figure 1 The expression of PLK1 in choroidal vascular endothelial cells and choroidal melanoma cells

2.2 構建PLK1敲低的脈絡膜黑色素瘤C918細胞模型

RT-qPCR實驗表明:相比于Scr對照組,sh1、sh2組的PLK1 mRNA水平顯著減少,且差異具有統計學意義(P<0.05,見圖2A)。同時,我們也進行了Western blot實驗,結果表明:與NC組比較,sh1、sh2組的PLK1蛋白水平明顯降低(見圖2B)。RT-qPCR實驗和Western blot實驗結果證實C918細胞的PLK1敲低模型構建成功。

圖2 C918細胞感染PLK1慢病毒后敲低效果驗證Figure 2 Validation of knockdown efficacy in C918 cells infected with PLK1 lentivirus

2.3 敲低PLK1抑制C918細胞增殖

CCK-8實驗實驗結果顯示:隨著時間的延長,相比于NC組,sh1組和sh2組的細胞增殖能力逐漸減弱,且在72 h時差異具有統計學意義(P<0.05,見圖3A)。隨后的克隆形成實驗結果也表明:相比于NC組,sh1組和sh2組的克隆數目明顯減少(P<0.05,見圖3B)。

與NC組比較,*P<0.05圖3 敲低PLK1對C918細胞增殖的影響Figure 3 The effect of knocking down PLK1 on the proliferation of C918 cells

2.4 敲低PLK1后將細胞周期阻滯于S期

流式細胞儀檢測結果證實:相比于NC組,sh1組和sh2組處于S期的細胞比例明顯增多,G2/M細胞比例明顯減少,且差異具有統計學意義(P<0.05,見圖4)。

圖4 敲低PLK1對C918細胞周期的影響Figure 4 The effect of PLK1 knockdown on the cell cycle of C918

2.5 敲低PLK1降低BUBR1基因的轉錄

RT-qPCR結果表明PLK1敲低后BUBR1 mRNA水平顯著下降(P<0.05,見圖5)。

與NC組比較,*P<0.05圖5 RT-qPCR檢測敲低PLK1表達后其可能的下游靶基因變化Figure 5 Expression of possible downstream target genes after knocking down PLK1 by RT-qPCR

2.6 敲低PLK1減少BUBR1的蛋白表達水平

Western blot實驗檢測BUBR1的蛋白表達,結果顯示:相比于NC組,sh1組和sh2組的PLK1蛋白表達量明顯減少(見圖6)。

圖6 敲低PLK1對BUBR1蛋白表達的影響Figure 6 The effect of knocking down PLK1 on the expression of BUBR1 protein

2.7 敲低PLK1減少組蛋白H3T3ph修飾水平

Western blot結果證實:敲低PLK1后H3T3ph修飾的表達水平明顯降低(見圖7)。

圖7 敲低PLK1對組蛋白H3T3ph修飾的影響Figure 7 The effect of knockdown of PLK1 on histone H3T3ph modification

2.8 組蛋白H3T3ph修飾能夠富集在BUBR1基因的啟動子上

ChIP實驗結果表明:相比于IgG,組蛋白H3T3ph修飾能夠富集在引物3處,即啟動子上游-500 bp至-1 000 bp區域(P<0.05,見圖8)。

圖8 組蛋白H3T3ph修飾在BUBR1基因的啟動子上的富集情況Figure 8 Enrichment of histone H3T3ph modification on the promoter of BUBR1 gene

3 討論

polo樣激酶家族(polo-like kinases,PLKs)是一類結構和功能均高度保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶,可參與細胞周期不同階段的調控。哺乳動物中PLKs分為5個亞型,結構具有相似性,即N末端為高度保守的激酶結構域,其是一個催化T-loop,允許PLKs將ATP轉化為ADP并將磷酸基轉移到PLKs下游的任何一個磷酸化目標上[3];C端為催化活性及亞細胞動態定位的特征性PBD(polo-box domain)結構域,能夠特異性識別磷酸化位點,是PLKs定位與靶向的關鍵[4]。PLK1是polo樣激酶家族中備受關注的成員,能夠調控細胞周期,并能促進中心體成熟、染色體分裂和胞質分裂等,其功能的實現可能與下游蛋白(FoxM1、Myc、Mdm2、Pten及P53等)的相互作用和激活有關[5]。目前研究發現,PLK1在多種腫瘤中高表達,包括肺癌、頭頸部腫瘤、食管癌、胃癌、乳腺癌及前列腺癌[6];并且有研究表明PLK1能夠參與順鉑耐藥[7],提示PLK1在人類腫瘤發生發展中具有重要作用,但關于PLK1在脈絡膜黑色素瘤中的作用尚未見相關研究報道。

我們首先證實PLK1在脈絡膜黑色素瘤細胞中高表達,且在C918細胞中表達量最高;隨后構建脈絡膜黑色素瘤的PLK1敲低的C918細胞模型,RT-qPCR和Western blot實驗顯示PLK1 shRNA慢病毒敲低效果較好,證實PLK1敲低細胞模型構建成功。隨后通過CCK-8和克隆形成實驗證實,敲低PLK1能顯著抑制C918細胞增殖,且能將細胞周期阻滯于S期,使得細胞無法正常向G2/M期分裂。為探究PLK1調控脈絡膜黑色素瘤細胞增殖的分子機制,我們使用RT-qPCR檢測了多種細胞增殖相關基因的變化,結果表明敲低PLK1可以減少BUBR1的mRNA水平,Western blot實驗結果顯示敲低PLK1能顯著下調BUBR1的蛋白表達水平。

BUBR1作為有絲分裂檢查點中一個極其關鍵的蛋白,在染色體的分離、排列和細胞分裂過程中發揮重要功能,從而保證細胞周期的順利進行[8]。已有研究證實,BUBR1在食管癌、腎癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌,乳腺癌中異常高表達[9-14],且與腫瘤病人的不良預后具有相關性。我們的研究初步證實PLK1可能是通過調控BUBR1基因的表達進而促進絡膜黑色素瘤細胞的增殖。緊接著我們進一步探究PLK1調控BUBR1基因表達的分子機制。

組蛋白磷酸化(histone phosphorylation)指在組蛋白的N末端結合帶有負電荷的磷酸基團,是真核生物最廣泛的蛋白修飾之一。這一過程是可逆的,磷酸化修飾常發生在組蛋白的絲氨酸/蘇氨酸殘基上。許多組蛋白的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化與基因轉錄激活、細胞周期依賴的染色體縮合、DNA修復和凋亡誘導的染色質致密化有關[15]。組蛋白磷酸化修飾主要由Haspin、MSK1、MSK2、CKII、Mst1等核蛋白激酶直接催化介導。已有研究證實PLK1能夠調控Haspin進而激活組蛋白H3第三位蘇氨酸的磷酸化(H3T3ph)修飾[16],提示PLK1可能在基因轉錄調控中發揮重要功能。Western blot結果表明敲低PLK1可以減少C918細胞中的組蛋白H3T3ph修飾表達水平,并且ChIP實驗證實H3T3ph能夠富集在BUBR1的啟動子上游-500 bp至-1 000 bp區域,這些結果說明PLK1很可能是通過介導H3T3ph修飾在BUBR1的啟動子上富集來調控BUBR1的基因轉錄,但這一結論仍需通過更多實驗進行驗證。

綜上,本研究初步證實PLK1能促進脈絡膜黑色素瘤細胞的增殖,其機制可能與PLK1調控BUBR1基因的轉錄相關。因此,本研究為PLK1用于脈絡膜黑色素瘤的早期診斷和治療提供新的思路和參考。