小檗胺對糖尿病心肌病心肌損傷的保護作用及其機制

董文婷,尚福軍,郭 錦,劉治國,劉 慧,劉艷麗*

(1西安國際醫學中心醫院心臟內科,西安 710100;2臨汾經濟技術開發區新立醫院內科;3空軍軍醫大學唐都醫院心內科;*通訊作者,E-mail:yanliliugjyxzx@126.com)

糖尿病是一種以長期高血糖為特征的慢性內分泌代謝綜合疾病,嚴重威脅著人類健康[1]。糖尿病患者晚期往往會存在異常的心肌結構和功能改變,即出現糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)[2]。這些改變以心肌纖維化、病理重塑和心功能障礙為特征,且不受冠狀動脈疾病、瓣膜病、高血壓和血脂異常等常規心血管危險因素的影響[3,4]。目前尚沒有一種臨床治療方法可以緩解這種特定形式的心臟病,因此亟待探索有效的藥物和分子靶點來控制糖尿病心肌病的發生發展。

小檗胺(berbamine,BBM)是存在于小檗屬植物中的一種雙芐基異喹啉類生物堿,具有抗癌、抗氧化、抗炎和免疫調節等多種藥理學作用[5,6]。近年來研究發現,小檗胺在心血管系統及其相關疾病方面都發揮了重要的保護作用[7]。然而小檗胺能否抵抗糖尿病心肌病心肌損傷并延緩其發生發展尚無研究報道。因此,本研究采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)聯合高糖脂飲食法建立小鼠糖尿病心肌病模型,以觀察小檗胺對糖尿病心肌病的保護作用并探討其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

清潔級雄性C57BL/6小鼠60只,8周齡,飼養于清潔級環境中,購自空軍軍醫大學實驗動物中心。使用許可證號:SYXK(軍)2012-0022。小檗胺(BBM,貨號:547190)和鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ,貨號:S0130)購自美國Sigma公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD,貨號:A001-3-2)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px,貨號:A005-1-2)和丙二醛(malondialdehyde,MDA,貨號:A003-1-2)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。SIRT3(貨號:ab246522)、gp91phox(貨號:ab129068)、Collagen-1(貨號:ab260043)和β-actin(貨號:ab8226)抗體購自美國Abcam公司。Ac-FOXO3a(貨號:#9441)和FOXO3a(貨號:#2497)抗體購自美國Cell Signaling公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立及分組處理 將60只小鼠隨機分為以下4組:正常對照組(control組)、單純藥物處理正常對照組(Con+BBM組)、糖尿病心肌病組(DCM組)和DCM+BBM組(糖尿病心肌病+藥物處理組),每組15只。糖尿病心肌病模型建立方法如下:出生8周的C57BL/6雄性小鼠,連續3 d腹腔注射STZ,60 mg/(kg·d),每次腹腔注射前禁食12 h;2周后,禁食8 h,測量空腹血糖,血糖值≥11.1 mmol/L為糖尿病造模成功;已成糖尿病的小鼠,繼續給予高熱量飼料喂養12周,構成糖尿病心肌病模型。

control組和DCM組灌胃生理鹽水,Con+BBM組灌胃BBM(100 mg/kg),DCM+BBM組小鼠在STZ注射2周后,每天通過灌胃補充小檗胺處理(100 mg/kg)共12周。實驗所需的BBM及STZ劑量參考文獻[8,9]。待實驗結束后,用小動物超聲儀檢測小鼠心臟收縮功能;HE染色法觀察小鼠左心室心肌細胞橫截面積;計算各組小鼠HMI和LVMI;Masson染色法觀察心肌組織纖維化程度;免疫組化染色法檢測心肌組織Collagen-1表達程度;分光光度法檢測心肌組織中SOD、GSH-Px和MDA的含量;RT-PCR法檢測心肌肥厚相關基因α-MHC和β-MHC的表達水平;Western blot法檢測SIRT3、Ac-FOXO3a和gp91phox的蛋白表達水平。

1.2.2 心功能測定 小鼠行心臟超聲檢測前一天,胸部脫毛,異氟烷吸入麻醉。置于恒溫檢測臺上,當心率維持在400-500次/min,調整超聲探頭,利用VisualSonics Vevo 2100高分辨率小動物超聲系統和專用于小鼠的RMV 707B高頻探頭,進行M型超聲檢測。檢測左室射血分數(left ventricular ejection,LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)。

1.2.3 心肌肥厚指數HMI和LVMI測定 小鼠稱重后處死,立即取下心臟及右下肢脛骨,分別測量心臟的全心質量、左心室質量以及脛骨長度,心肌肥厚指數HMI(heart mass index)和LVMI(left ventricular mass index)以全心質量/體質量(mg/g)及左心室質量/體質量比(mg/g)計算。

1.2.4 心臟組織學染色 小鼠心臟取材后制備成石蠟切片,用蘇木精-伊紅(HE)染色以觀察心肌細胞橫截面積,用Masson染色以觀察心肌組織纖維化情況。將石蠟切片與含有5% BSA的Collagen-1一抗孵育行免疫組化染色,以檢測心肌組織膠原蛋白表達程度。

1.2.5 SOD、GSH-Px和MDA含量測定 心肌組織中抗氧化物SOD、GSH-Px和脂質過氧化物MDA的含量基于試劑盒要求測定,并檢測吸光度值,分光光度法分析數據。

1.2.6 RT-PCR法檢測α-MHC和β-MHC基因表達水平 RT-PCR法檢測心肌肥厚相關基因α-MHC和β-MHC表達。用TRIzol試劑從組織中分離總RNA,對RNA進行逆轉錄以合成cDNA,用分光光度法測定RNA和cDNA的濃度和純度。引物采用Primer Premier 6.0軟件設計,由上海吉凱基因有限公司合成。在iQTM5 RT-PCR系統中進行PCR擴增,采用2-ΔΔCt法對靶基因表達量進行相對定量。引物序列見表1。

表1 心肌肥厚基因α-MHC和β-MHC引物序列

1.2.7 Western Blot法檢測SIRT3、Ac-FOXO3a、FOXO3a和gp91phox蛋白表達水平 取50 μg總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離,并轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶在37 ℃下封閉膜2 h,用特異性SIRT3(1 ∶1 000)、Ac-FOXO3a(1 ∶500)、FOXO3a(1 ∶500)和gp91phox(1 ∶1 000)一抗孵育24 h。然后用相應的酶標二抗在37 ℃下孵育膜1 h。用ECL發光液并通過Bio-Rad系統成像,觀察膜上的蛋白條帶。以β-actin作為內參,檢測各蛋白的表達情況。

1.3 統計學分析

實驗數據以均數±標準差表示,多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),兩兩比較采用Bonferroni檢驗。數據采用Prism 5.0軟件進行分析,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小檗胺顯著改善糖尿病心肌病小鼠心臟功能損傷

超聲檢測結果顯示,與control組相比,DCM組小鼠的心臟收縮功能顯著下降,表現為LVEF和LVFS值明顯降低(P<0.05),給予小檗胺處理后,與DCM組相比,DCM+BBM組小鼠的心臟收縮功能顯著提高(P<0.05);Con+BBM組小鼠的LVEF與LVFS值與control組相比差異無統計學意義(P>0.05,見圖1)。

2.2 小檗胺顯著改善糖尿病心肌病小鼠心肌肥厚程度

組織學檢測指標顯示,與control組相比,DCM組小鼠的HMI和LVMI顯著升高(P<0.05);給予小檗胺處理后,與DCM組相比,DCM+BBM組小鼠的HMI和LVMI值顯著降低(P<0.05)。HE染色顯示,與control組相比,DCM組小鼠的心肌細胞橫截面積顯著增大(P<0.05);給予小檗胺處理后,與DCM組相比,DCM+BBM組小鼠的心肌細胞橫截面積顯著縮小(P<0.05,見圖2,3)。心肌肥厚相關基因檢測顯示,與control組相比,DCM組小鼠心肌組織α-MHC表達明顯下調,β-MHC的顯著表達上調(P<0.05);給予小檗胺處理后,與DCM組相比,DCM+BBM組小鼠心肌組織α-MHC/β-MHC的比例被顯著逆轉(P<0.05,見圖2,3)。Con+BBM組小鼠的HMI和LVMI值、心肌細胞橫截面積及α-MHC/β-MHC的比例與control組相比差異均無統計學意義(P>0.05,見圖2,3)。

與control組相比,*P<0.05,**P<0.01;與DCM組相比,##P<0.01圖1 各組小鼠心臟超聲檢測結果比較Figure 1 Comparison of ultrasonic parameter between groups

與control組相比,*P<0.05,**P<0.01;與DCM組相比,##P<0.01圖2 各組小鼠心肌肥厚指標比較Figure 2 Comparison of indexes of cardiac hypertrophy between groups

圖3 各組小鼠心肌細胞平均橫截面積比較 (HE染色)Figure 3 Comparison of mean cross-sectional area of cardiomyocyte between groups (HE staining)

2.3 小檗胺顯著減輕糖尿病心肌病小鼠心肌纖維化程度

Masson及Collagen-1染色顯示,與control組相比,DCM組小鼠的膠原纖維含量顯著增加,心肌纖維化程度顯著升高(P<0.05),給予小檗胺處理后,與DCM組相比,DCM+BBM組膠原纖維含量顯著降低,小鼠心肌纖維化進展被明顯抑制(P<0.05);Con+BBM組小鼠的心肌纖維化程度與control組相比差異無統計學意義(P>0.05,見圖4)。

與control組相比,**P<0.01;與DCM組相比,##P<0.01圖4 各組小鼠心肌纖維化程度比較Figure 4 Comparison of the degree of myocardial fibrosis between groups

2.4 小檗胺顯著減輕糖尿病心肌病小鼠心肌組織氧化應激損傷

與control組相比,DCM組小鼠心肌組織中抗氧化物SOD及GSH-Px活性顯著降低,脂質過氧化產物MDA含量顯著升高,并且氧化應激標志蛋白gp91phox表達顯著上升(P<0.05),給予小檗胺處理后,與DCM組相比,DCM+BBM組小鼠抗氧化物質顯著上升,心肌組織的氧化應激水平明顯下降(P<0.05);Con+BBM組小鼠上述心肌氧化應激指標與control組相比差異均無統計學意義(P>0.05,見圖5)。

2.5 小檗胺顯著上調糖尿病心肌病小鼠心肌組織SIRT3信號表達

與control組比較,DCM組小鼠心肌組織SIRT3蛋白表達水平及去乙酰化活性均明顯下調,FOXO3a乙酰化程度顯著上升(P<0.05),給予小檗胺處理后,與DCM組相比,DCM+BBM組小鼠心肌組織SIRT3蛋白表達水平及去乙酰化活性均明顯上調,FOXO3a乙酰化程度顯著下降(P<0.05);Con+BBM組小鼠心肌組織SIRT3通路表達與control組相比差異無統計學意義(P>0.05,見圖6)。

與control組相比,*P<0.05,**P<0.01;與DCM組相比,#P<0.05,##P<0.01圖5 各組小鼠心肌氧化應激水平比較Figure 5 Comparison of myocardial oxidative stress level between groups

3 討論

糖尿病發病率逐年攀升,已成為威脅世界健康的最常見疾病之一[10]。臨床研究發現,糖尿病心肌病是由長期高血糖狀態發展導致的心肌細胞代謝紊亂和心臟微血管病變,繼而引起心臟結構和功能異常,并最終導致心絞痛、心力衰竭和心律失常等不良事件的發生,嚴重影響了糖尿病患者的預后[11]。考慮到傳統的抗糖尿病藥物不能完全預防這一心血管并發癥的發生和進展,因此亟需尋找一種針對糖尿病心肌病病理生理改變的新的治療藥物。

近年來,天然植物提取物已被廣泛應用于包括糖尿病在內的多種疾病的治療或輔助治療中。一種從伏牛花植物中提取的小分子化合物小檗胺被發現對糖尿病及其相關器官損害均表現出了保護作用[12-14],并且大量文獻也報道小檗胺可以減輕多種致病因素導致的心肌損傷[15-17]。然而,其能否同樣緩解糖尿病心肌病心肌損傷有待進一步探究。糖尿病心肌病終末階段可以表現出明顯的心臟收縮功能障礙,且一般被認為是不可逆損傷。我們的研究首先發現,與control組相比,DCM組小鼠的心臟收縮功能顯著下降,表現為LVEF和LVFS值明顯降低,而給予小檗胺處理后,可以顯著提高糖尿病心肌病小鼠心臟收縮功能。以上結果提示,小檗胺對于糖尿病心肌病心肌損傷具有潛在的緩解作用。

心肌肥厚和心肌纖維化是糖尿病心肌病心肌重塑的特征性病理改變。長期慢性損傷加之負荷過重導致心肌細胞肥大,進而引起左心室重量增加及左心室壁增厚[18]。在外部環境因素的刺激下,心肌細胞外基質異常沉積和膠原纖維含量增加共同促進了心肌纖維化的發生發展,最終參與心臟結構和功能的破壞[19]。本研究結果顯示,給予小檗胺處理能夠顯著緩解糖尿病心肌病小鼠心肌細胞肥大和左室質量增加,并能明顯抑制心肌膠原纖維沉積,提示小檗胺能夠顯著抑制糖尿病心肌肥厚和心肌纖維化進展。肌凝蛋白重鏈(myosin heavy chain,MHC)是肌凝蛋白的基本單位,在保證肌細胞正常功能中起著重要作用。肌球蛋白重鏈的兩種異構體α-MHC和β-MHC在肥厚的心臟中發生典型的MHC變化,即由α-MHC變為β-MHC[20]。本實驗結果也證實,小檗胺處理能夠顯著上調糖尿病心肌組織α-MHC的基因表達,并明顯下調β-MHC基因的表達,進一步驗證了小檗胺逆轉糖尿病心肌肥厚的作用。

與control組相比,*P<0.05,**P<0.01;與DCM組相比,##P<0.01圖6 各組小鼠心肌組織SIRT3/FOXO3a通路表達比較Figure 6 Comparison of protein expression of cardiac SIRT3/FOXO3a signaling between groups

以往研究證實,心肌組織氧化應激損傷是糖尿病心肌病發生發展的關鍵因素之一[21]。與糖尿病相關的代謝環境,如高血糖、高脂血癥和高胰島素血癥,會直接導致線粒體和非線粒體來源的ROS生成增加[22]。過度刺激產生的ROS會進一步引發內源性抗氧化物的耗竭以及促氧化損傷產物的積累[9]。同時,糖尿病心肌纖維化和心肌肥厚也與氧化應激損傷密切相關。一方面,ROS過量產生可誘導TGF-β1/Smad3信號激活,促進多種纖維化標志物的表達,導致心肌成纖維細胞增殖和膠原合成[23]。另一方面,氧化應激損傷可導致肌凝蛋白重鏈由α-MHC亞型向β-MHC亞型轉換,標志著心肌肥厚的進展[24]。因此,減輕心肌組織氧化應激損傷將是治療糖尿病心肌病的一個重要策略。小檗胺前期被證實具有廣泛的心血管藥理作用,且因其高效的抗氧化活性在多種致病因素導致的心肌損傷中表現出了保護效應[7,16,25]。本研究發現,給予小檗胺處理后,糖尿病小鼠心肌組織抗氧化物SOD及GSH-Px活性顯著上升,脂質過氧化產物MDA含量顯著降低,并且氧化應激標志蛋白gp91phox表達顯著下降,有效抑制了心肌組織的氧化應激水平,提示小檗胺同樣能夠通過發揮抗氧化應激作用,減輕糖尿病心肌損傷。

沉默信息調控因子3(silent information regulator 3,SIRT3)是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙酰化酶,主要定位于線粒體。因其對線粒體相關酶的去乙酰化作用,可通過對能量代謝、氧化應激等的調節,在心臟領域扮演重要角色[26]。既往研究表明,以SIRT3分子為靶點,上調SIRT3的表達在心肌損傷保護方面發揮了關鍵作用[27]。作為SIRT3下游調控分子,FOXO3a去乙酰化后能促進過氧化氫酶和超氧化物歧化酶基因轉錄,進而增強心肌細胞對氧化應激損傷的抵抗作用[28]。然而SIRT3/FOXO3a通路能否介導小檗胺減輕糖尿病心肌病心肌損傷仍有待于進一步探究。本研究結果顯示,與control組相比,DCM組小鼠心肌組織SIRT3的表達及去乙酰化活性顯著下調,Ac-FOXO3a表達明顯上升;給予小檗胺處理能夠顯著激活SIRT3的表達并增強其去乙酰化活性,同時抑制Ac-FOXO3a的表達,提示小檗胺可能通過激活心肌細胞內SIRT3/FOXO3a通路降低氧化應激水平,繼而減輕糖尿病心肌病心肌細胞的損傷。

綜上所述,本研究首次發現小檗胺具有顯著的抗糖尿病心肌病心肌損傷的作用,能夠有效抑制心肌氧化應激損傷、減緩心肌重構并改善小鼠心臟功能惡化,其分子機制可能與激活心肌SIRT3/FOXO3a信號有關。我們的研究為臨床上應用小檗胺減輕糖尿病心肌病患者的心臟損傷提供了新的理論依據。