抗乙酰基轉(zhuǎn)移酶TIP60單克隆抗體的制備與鑒定

劉樹玲,趙陶然,陸 昕,米臘臘,趙興卉,劉志貞*

(1軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所,北京 100071;2山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,出生缺陷與細(xì)胞再生山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3山西醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;4山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心;#共同第一作者;*通訊作者,E-mail:zhizhenliu2013@163.com;**共同通訊作者,E-mail:xinghui-zhao@163.com)

Tat相互作用蛋白60(Tat-interactive protein 60,TIP60)也稱作KAT5或HTATIP,是乙酰基轉(zhuǎn)移酶MYST(MOZ,YBF2,SAS2和TIP60)家族的成員之一。TIP60蛋白由N端染色質(zhì)桶裝結(jié)構(gòu)域(TIP60-CB)和C端乙酰化結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,其中C端乙酰化結(jié)構(gòu)域中含有一段保守的MYST乙酰基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)將乙酰基從乙酰CoA轉(zhuǎn)移到底物賴氨酸的α-氨基上[1],實(shí)現(xiàn)蛋白的乙酰化修飾。

TIP60能夠催化一系列組蛋白的乙酰化,如H2A的K5,H3的K14,H4的K5、K8、K12、K16,但并不能乙酰化H2B[2]。除此之外,TIP60還可以乙酰化一系列轉(zhuǎn)錄因子及DNA損傷反應(yīng)相關(guān)蛋白,如c-Myc[3]、STAT3[4]、E2F1[5]、ATM[6]、C/EBPα[7]和p53[8]等。因此,TIP60在DNA損傷修復(fù)[9,10]、檢查點(diǎn)激活[6]、p53指導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[11,12]、衰老和自噬[13]等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外,TIP60還在Ras/p38信號(hào)傳導(dǎo)[14]和胰島素/AKT信號(hào)傳導(dǎo)[15]等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著重要的中介作用[16]。

我們在TIP60與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的研究中,為了檢測細(xì)胞內(nèi)的TIP60蛋白水平以及免疫共沉淀捕獲TIP60相互作用蛋白,使用商品化的抗TIP60抗體,但效果均不理想。為了解決這一問題,我們分析了TIP60蛋白結(jié)構(gòu),選取N端一段氨基酸序列合成多肽,作為抗原免疫小鼠,并通過親和層析純化,成功制備了抗TIP60單克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

雌性8周齡BALB/c小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑購自Sigma-Aldrich(USA)公司,骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)、293T細(xì)胞、大鼠巨噬細(xì)胞RMa-bm、小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為本室保存。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基為Gibco(USA)公司產(chǎn)品。HAT培養(yǎng)基和HT培養(yǎng)基按常規(guī)配制。硝酸纖維膜為Millipore(USA)公司產(chǎn)品。HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗為Abcam(USA)公司產(chǎn)品。Pierce ECL Western Blotting Substrate印記檢測試劑為Thermo Fisher(USA)公司產(chǎn)品。Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit為Roche(USA)公司產(chǎn)品。

1.2 抗原肽段制備

通過TIP60結(jié)構(gòu)分析,確定用于小鼠免疫的表位序列為N端11-30號(hào)氨基酸殘基CRLPVLRRNQDNEDEWPLAE,為了增加多肽的免疫原性,在N端進(jìn)行血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)修飾。多肽的合成與修飾委托南京金斯瑞生物科技公司完成。

1.3 動(dòng)物免疫

將制備好的KLH修飾多肽與弗氏完全佐劑充分混合,在每只小鼠腹股溝皮下多點(diǎn)注射20 μg(共免疫3只小鼠),2周和4周后分別以KLH修飾多肽加弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫一次,方法同首次免疫。融合前3 d再次加強(qiáng)免疫一次。

1.4 雜交瘤細(xì)胞制備與單克隆篩選

無菌條件下取免疫小鼠脾臟,制備脾細(xì)胞懸液,與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合后,接種于預(yù)先加入滋養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng),融合后第4天更換培養(yǎng)液,換液時(shí)吸去全部培養(yǎng)液,加入200 μl新鮮含HAT的培養(yǎng)液。觀察細(xì)胞克隆長至1/3-1/2培養(yǎng)孔面積時(shí),對細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測,篩選陽性克隆。初次克隆時(shí)換HT培養(yǎng)液,用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆化,連續(xù)亞克隆3次以上,陽性率達(dá)100%。

1.5 單克隆抗體腹水制備及檢測

腹水制備前1個(gè)月給小鼠腹腔注射石蠟油(0.5 ml/只)。用篩選出的陽性克隆雜交瘤細(xì)胞懸液對小鼠腹腔注射(1×106細(xì)胞/只)誘導(dǎo)腹水產(chǎn)生。5-6 d后收集小鼠腹水,然后用蛋白G柱(GE公司,USA)純化抗體,并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 抗體亞型鑒定

收集雜交瘤細(xì)胞表達(dá)上清,用PBST稀釋100倍后,加入預(yù)包被抗小鼠不同Ig亞型抗體的酶標(biāo)板(上海博湖生物技術(shù)有限公司)孔中,每孔50 μl,再加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgM抗體每孔50 μl。混勻后室溫孵育1 h。倒掉板中液體,充分清洗后加入顯色劑顯色,顯色最深的孔為相應(yīng)抗體亞型。

1.7 Western blot法檢測抗體特異性

收集過表達(dá)人TIP60蛋白的293T細(xì)胞、大鼠巨噬細(xì)胞或小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞,提取細(xì)胞全蛋白,經(jīng)過SDS-PAGE電泳后,將蛋白轉(zhuǎn)印在硝酸纖維膜,用5%脫脂奶粉(溶于TBST溶液)封閉后,用雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為一抗、或商品化的抗TIP60抗體室溫孵育2 h,TBST洗3次后,加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為二抗孵育,用ECL顯色后觀察抗體結(jié)合效果。

1.8 免疫共沉淀及質(zhì)譜樣品制備

收集培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞,提取細(xì)胞全蛋白,加入2 μg純化后的anti-TIP60 mAb,4 ℃孵育1 h,之后加入20 μl蛋白A/G凝膠顆粒,4 ℃顛倒孵育2 h。孵育結(jié)束后,離心收集凝膠顆粒并清洗兩次2次。用0.1 mol/L甘氨酸(pH3.5)將凝膠顆粒上捕獲的蛋白洗脫下來,中和后用0.1 mol/L DTT還原蛋白種的二硫鍵,然后用吲哚乙酸(溶于50 mmol/L NH4HCO3,終濃度為50 mmol/L)烷基化,最后用加入1%甲酸將樣品酸化后,送去質(zhì)譜檢測。

2 結(jié)果

2.1 TIP60蛋白的抗原表位預(yù)測

通過uniport數(shù)據(jù)庫獲取人TIP60蛋白的信息,該蛋白現(xiàn)有的不完全晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)顯示,TIP60蛋白N端的染色質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域1-80位氨基酸中含有4個(gè)β片層,3個(gè)α螺旋,其中,b1和b2之間形成一個(gè)特殊的發(fā)卡結(jié)構(gòu)(見圖1A),而C端乙酰化結(jié)構(gòu)域227-506位氨基酸中含有13個(gè)β片層,9個(gè)α螺旋(見圖1B)。通過DNAstar-protean軟件分析TIP60蛋白的氨基酸序列分布情況顯示該蛋白整體親水性較強(qiáng)(見圖1C)。基于以上信息,選擇TIP60 N端包含發(fā)卡結(jié)構(gòu)的11-30位氨基酸(圖1A紅色區(qū)域、圖1C紅框區(qū)域)這段包含暴露在二級(jí)結(jié)構(gòu)外的、具有較強(qiáng)親水性的多肽序列作為抗原序列。

圖1 DNAstar-protean軟件預(yù)測TIP60抗原表位Figure 1 TIP60 epitope prediction by DNAstar-protean

2.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立

取免疫后小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞,經(jīng)細(xì)胞融合和初步篩選后,共獲得8株單克隆細(xì)胞株。通過Western blot檢測8株單克隆細(xì)胞株的培養(yǎng)上清中的抗體,是否能識(shí)別293T細(xì)胞中過表達(dá)的人TIP60蛋白。在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HA-TIP60過表達(dá)質(zhì)粒,待目的基因表達(dá)后,收集細(xì)胞提取全蛋白,通過電泳轉(zhuǎn)膜和ECl顯影,結(jié)果顯示,2#、4#、5#、6#、7#和8#單克隆細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體在稍低于70 kD處有條帶,但是只有4#條帶最為明顯和單一(見圖2)。

圖2 Western blot法鑒定單克隆細(xì)胞株培養(yǎng)上清對293T細(xì)胞中過表達(dá)的人TIP60蛋白的結(jié)合Figure 2 Identification of the binding of the culture supernatant of the monoclonal cell line to human TIP60 protein overexpressed in 293T cell by Western blot

2.3 抗體亞型的鑒定

通過小鼠亞類鑒定試劑盒鑒定后,抗體亞型為IgG1型。

2.4 鑒定TIP60在細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用

為了進(jìn)一步驗(yàn)證獲得的抗體對TIP60蛋白的識(shí)別,以及研究TIP60在細(xì)胞中相互作用的蛋白,利用獲得的4# aiti-TIP60 mAb包被蛋白A/G凝膠顆粒,與HepG2細(xì)胞裂解液共同孵育富集TIP60及其相互作用蛋白,將獲得的蛋白復(fù)合物進(jìn)行質(zhì)譜檢測。結(jié)果顯示,免疫共沉淀復(fù)合物中豐度最高的成分為TIP60(同工酶3),共鑒定到12個(gè)特異性肽段,此外還有多種核蛋白及核糖體蛋白(見表1)。

表1 質(zhì)譜鑒定4# aiti-TIP60 mAb在HepG2細(xì)胞中所捕獲蛋白

2.5 抗體種屬特異性的鑒定

在TIP60的研究中,小鼠和大鼠及這兩種動(dòng)物來源的細(xì)胞都是常有的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?通過BLAST比對,發(fā)現(xiàn)人(Q92993)和大鼠(Q99MK2)以及人(Q92993)和小鼠(Q8CHK4)的TIP60基因序列的一致性高達(dá)99.8%(見圖3),這提示人、大鼠和小鼠來源的TIP60蛋白可能具有較高的結(jié)構(gòu)相似性。

圖3 人(Q92993)和大鼠(Q99MK2)以及人(Q92993)和小鼠(Q8CHK4)的TIP60基因序列比對Figure 3 TIP60 gene sequence alignment between human(Q92993) and rat(Q99MK2) as well as human(Q92993) and mouse(Q8CHK4)

進(jìn)一步收集大鼠巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞,提取全蛋白,4#mAb檢測其中的TIP60蛋白,通過電泳轉(zhuǎn)膜和ECl顯影,結(jié)果顯示,這株抗體能夠特異性識(shí)別大鼠和小鼠細(xì)胞內(nèi)源性產(chǎn)生的TIP60蛋白(見圖4)。

圖4 Western blot法鑒定單克隆細(xì)胞株培養(yǎng)上清對大鼠巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞TIP60蛋白的結(jié)合Figure 4 Identification of the binding of the culture supernatant of the monoclonal cell line to the TIP60 protein in rat macrophages and mouse macrophages by Western blot

3 討論

人類TIP60蛋白有多種剪切體,本研究通過uniport數(shù)據(jù)庫獲取人TIP60氨基酸序列,運(yùn)用生物信息學(xué)的方法通過DNAstar-Protein軟件、分析TIP60蛋白親水性、表面可及性和抗原指數(shù),結(jié)合該蛋白部分PBD結(jié)構(gòu)信息,選擇保守序列N端11-30位氨基酸作為抗原表位區(qū)。合成多肽序列并偶聯(lián)KLH修飾作為抗原,通過免疫小鼠,并構(gòu)建融合瘤細(xì)胞,獲得了8個(gè)單克隆細(xì)胞株。通過SDS-PAGE電泳分離和Western blot初步鑒定篩選出4#單克隆細(xì)胞株,它產(chǎn)生的抗體在60 kD左右的位置產(chǎn)生特異條帶。用4#單克隆細(xì)胞株刺激小鼠產(chǎn)生腹水,純化腹水得到單克隆抗體4# anti-TIP60 mAb。通過質(zhì)譜檢測4# anti-TIP60 mAb所捕獲的HepG2細(xì)胞蛋白,鑒定到了豐富的TIP60特征肽段。這進(jìn)一步證明4# anti-TIP60 mAb對TIP60蛋白的特異性。由于人、大鼠和小鼠物種之間的TIP60蛋白具有較高的同源性,本研究獲得的4# anti-TIP60 mAb能夠與上述三種物種細(xì)胞內(nèi)源性產(chǎn)生的TIP60反應(yīng)。這株高特異性、多物種反應(yīng)性的抗TIP60抗體的制備,可以為TIP60生物功能研究提供可靠的幫助。

總之本研究通過生物信息學(xué)方法預(yù)測TIP60蛋白的抗原表位,合成KLH修飾的多肽序列,通過免疫小鼠、篩選細(xì)胞單克隆篩選獲得一株分泌TIP60抗體的雜交瘤細(xì)胞,經(jīng)過質(zhì)譜鑒定證明這株抗體可以準(zhǔn)確結(jié)合TIP60蛋白。此外,這株抗體可以識(shí)別人、大鼠、小鼠來源的TIP60蛋白。