JAK/STAT信號通路相關蛋白在脂質腎損害大鼠腎臟組織中的表達及意義

李莎莎,李 露,吳 璞,郝亞寧

(1西安醫學院第一附屬醫院腎內科,西安 710077;2西安市第九醫院腎內科;3西安交通大學第一附屬醫院腎內科;*通訊作者,E-mail:haoynhaoyn@163.com)

1982年,Moorhead等[1]提出“脂質腎毒性假說”,促進了腎臟病領域脂質代謝的研究。腎臟是繼心、腦血管之后遭到血脂異常危害的另一個靶器官。越來越多的研究證明,腎臟脂質過多沉積可能通過氧化應激、內質網應激、炎癥應激等多種機制導致慢性腎臟疾病[2,3]。JAK/STAT信號途徑(Janus Kinase-signal transducer and activator of transcription signaling pathway)是機體內普遍存在的一條細胞因子信號轉導途徑,通過細胞因子參與機體內免疫細胞分化、調節免疫應答、介導炎性反應等過程[4,5]。目前相關的研究發現參與此通路的細胞因子眾多,本課題組擬通過檢驗出異常表達的細胞因子包括STAT3、OSM等近一步闡述JAK/STAT信號通路及相關細胞因子在脂質腎損害發病機制中的作用。

1 材料及方法

1.1 動物分組

30只SD大鼠(西安交通大學醫學院動物中心提供),體質量120-140 g,適應性喂養1周后,按照隨機數字表法隨機分為:對照組(n=15)和高脂組(n=15),其中對照組給予普通飼料喂養,高脂組大鼠給予含2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、10%豬油、5%蛋黃粉的高脂飼料喂養。兩組均自由飲水。

1.2 實驗方法

1.2.1 觀察指標的變化 12周時將所有大鼠分別置于代謝籠中,收集24 h尿液,檢測24 h尿蛋白定量。處死大鼠后腹主動脈取血5-6 ml,分離血清,檢測血甘油三酯、總膽固醇、肌酐指標。

（3）加大對創新的支持力度，特別加大對初創、高速發展的創新型公司的支持，增加對有規模化發展潛力的創新想法的投入。

1.2.2 大鼠血清OSM濃度檢測 ELISA試劑盒(96T)購自美國RDBiosciences公司。按照該試劑盒使用說明書對原倍標準品進行倍比稀釋,取相應大鼠血清標本40 μl,加抗OSM抗體10 μl、鏈霉親和素-HRP 50 μl,并設復孔。室溫孵育30 min,洗滌液洗滌30 s×5次,每個孔依次加顯色液A 50 μl和顯色液B 50 μl,震蕩混勻10 s,37 ℃暗處反應10 min。最后每孔加入終止液50 μl,終止反應。于450 nm波長依次測定各吸光度(OD值)。用CurveExpert1.3軟件繪制出標準曲線,根據待測樣品的OD值可在標準曲線上計算出相應的OSM的含量。

JAK2、STAT3在兩組間表達無明顯變化,差異無統計學意義(見圖3)。與正常組比較,高脂組大鼠腎臟組織p-JAK2、p-STAT3表達增加(P<0.05,見圖3)。

與對照組比較,高脂組OSM主要表達于皮質腎小管上皮細胞胞膜和胞質、部分間質炎性細胞胞質及胞膜,腎小球內幾乎無表達(見圖2);高脂組OSMR表達明顯增加,主要位于皮質腎小管上皮細胞胞質及胞膜、腎間質,腎小球內皮細胞胞質少量表達,其余腎臟固有細胞幾乎無表達(見圖2)。

ELISA方法檢測兩組大鼠血清OSM的濃度，對照組OSM濃度為(22.64±4.52)ng/ml，高脂組OSM濃度為(27.57±7.17)ng/ml；與對照組比較，高脂組血清OSM水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

1.3 統計學方法

光鏡下HE染色,高脂組大鼠腎小球系膜細胞增多,系膜區增寬,腎小管上皮細胞濁腫,間質可見炎性細胞浸潤;PAS染色可見腎小球系膜基質明顯增多(見圖1)。

2.3.2 穩定性試驗 取同一供試品溶液（S6），按“2.2”項下的色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣測定，以12號色譜峰（黃芩苷）為參照峰，計算色譜圖中各共有峰相對保留時間的RSD小于0.47%，各共有峰相對峰面積的RSD小于1.49%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2 結果

2.1 大鼠血清甘油三脂、總膽固醇、24 h尿蛋白定量及血肌酐指標變化

高脂飲食造模12周時,高脂組大鼠血清總膽固醇、甘油三酯和24 h尿蛋白定量較對照組明顯升高(P<0.05),而血肌酐水平兩組間差異無統計學意義(見表1)。

表1 12周時兩組大鼠觀察指標變化

2.2 腎臟病理改變

圖1 兩組大鼠腎臟組織病理改變 (×400)Figure 1 Pathological changes of renal tissue in the two groups (×400)

2.3 血清OSM表達情況

1.2.5 Western blot法檢測JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白的表達 取新鮮凍存腎臟組織0.05 g加入蛋白裂解液0.5 ml,用勻漿器在冰上將腎臟組織勻漿并在冰上裂解20 min后于4 ℃ 15 000 r/min離心15 min收集上清液,考馬斯藍法測蛋白定量。取50 μg上清液蛋白上樣,10%SDS-聚丙烯胺凝膠電泳分離,將凝膠內蛋白質轉移到硝酸纖維膜上,5%脫脂奶粉室溫搖床上封閉1 h,根據JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白分子量大小裁膜,并分別加入兔抗大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3(1 ∶250),4 ℃孵育過夜,TBST洗膜液洗滌5 min×6次,再分別加入羊抗兔IgG二抗,按1 ∶15 000稀釋，室溫孵育1 h，TBST洗膜液洗滌5 min×6次，免疫熒光分析儀檢測蛋白表達，以Odyssey圖像處理系統分析蛋白表達灰度值，實驗結果用目的條帶灰度值與內參β-actin蛋白條帶灰度值的比值來表示。

堅持早中晚三巡塘制度，尤其是臺風、暴雨、連續陰雨等極端天氣，更應全天候堅持巡塘，觀察魚池水質變化及魚的活動情況，發現問題及時采取處置措施。通常采用的魚病防治方法有潑灑法、懸掛法和內服法。堅持定期潑灑藥物，按時掛簍掛袋，間隔投喂藥餌，防治結合，嚴格管控，堅決杜絕病害發生。一般每間隔15～20d，全池潑灑氯制劑一次，魚病高發時期每間隔15d用出血寧、五黃粉等藥物拌餌或制成藥餌投喂，用量一般為投餌量的0.5%左右。同時打掃好池塘衛生，及時清除殘餌及池中雜物，漁具使用后應放在陽光下曝曬，并藥浴消毒，保持池塘環境衛生，消除治病因子。

2.4 免疫組化法檢測OSM及OSMR蛋白表達情況

1.2.4 免疫組化檢測OSM及OSMR在腎臟組織中的表達 兔抗大鼠OSM多克隆抗體、兔抗大鼠OSMR多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司,均采用SP法,石蠟切片60 ℃烤箱2 h以上,常規脫蠟至水化,3%H202甲醇溶液消除內源性過氧化物酶,石蠟切片置pH6.6的檸檬酸緩沖液中,放于抗原修復儀5 min后自然冷卻。蒸餾水洗3次,正常山羊血清室溫封閉30 min后分別依次加入1 ∶100的兔抗大鼠多克隆抗體OSM及OSMR于4 ℃過夜。再分別加入二抗羊抗大鼠IgG室溫30 min,再次加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素,室溫孵育30 min,PBS漂洗3次;然后加入DAB室溫顯色1-2 min,光鏡下觀察著色情況,蒸餾水漂洗;再分別加入蘇木精染料2 min,1%氨水返藍,常規脫水、透明、封片并用顯微鏡成像系統采集圖片,OSM及OSMR免疫組化染色切片在光鏡下放大400倍,生物醫學圖像分析系統分析;OSM及OSMR免疫組化染色切片在光鏡下放大400倍觀察病理改變。

但是，實際上此時國民黨頑固派開始掀起了第二次反共高潮，救國會也因親共而受到打擊。憲政運動已完全消沉。1940年5月初，參謀總長兼軍政部長何應欽竟在國防最高會議上誣指沙千里、沈鈞儒和鄒韜奮企圖于“七七”抗戰紀念日在重慶領導暴動；如“七七”不成，在10月10日“雙十節”再暴動。顯然，這是一次有計劃的迫害。由于沙千里等及時揭露和斗爭，何應欽之流才沒有得逞。但是，一大群無辜青年因此而受到牽連，慘遭迫害。

圖2 兩組大鼠腎臟組織OSM及OSMR表達 (×400)Figure 2 Expression of OSM and OSMR in kidney tissues of rats in the two groups (×400)

2.5 兩組大鼠腎組織內JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達結果比較

1.2.3 HE及PAS染色觀察腎臟病理改變 處死大鼠,股主動脈取血后,同時給予4 ℃預冷的生理鹽水腎臟灌注后,取腎臟稱質量,將每只大鼠的一個腎臟置于4%多聚甲醛固定,以便制作石蠟切片,常規HE、PAS染色,觀察腎小球和腎小管間質病理改變。另一個腎臟組織置于液氮中,凍透后轉入-80 ℃冰箱保存備用。

與對照組相比,*P<0.05圖3 Western blot檢測兩組大鼠腎臟組織JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白的表達Figure 3 JAK2, p-JAK2, STAT3 and p-STAT3 protein expression in renal tissues of rats in the two groups by Western blot

2.6 腎臟組織中OSM及OSMR蛋白與24 h尿蛋白定量的相關性分析

高脂組腎臟組織中OSM蛋白的表達與24h尿蛋白定量表達呈高度正相關關系(r=0.979,P<0.01),腎臟組織中OSMR蛋白的表達與24 h尿蛋白定量表達呈高度正相關關系(r=0.963,P<0.01,見圖4)。

圖4 OSM、OSMR蛋白的相對表達與24 h尿蛋白定量的相關性分析Figure 4 Correlation of relative expression of OSM and OSMR proteins with 24 h urinary protein quantification

3 討論

近年來,隨著人們生活水平的提高,高脂血癥發生率不斷升高。脂質是一切細胞存活的基本組成成分。大多數細胞具有復雜的結構來調解脂質的進入、合成、儲存、利用與輸出。脂質過分堆積在細胞,超過細胞處理能力,將導致細胞損傷與功能障礙。目前越來越多的臨床及動物實驗研究證實,“脂質具有腎毒性”這一假說,之后一些學者推斷脂質可以導致腎小球系膜增殖,腎小管上皮細胞損傷,從而促進腎臟疾病的進展[6,7]。但脂質導致腎小管間質損傷可能的細胞信號通路及相關因子目前研究報道甚少。

JAK/STAT信號通路是機體內非常重要的一條由細胞因子刺激的信號轉導通路,大多數細胞因子主要通過JAK/STAT信號通路發揮其生物學功能。JAK/STAT信號通路的缺陷或異常活化與脂質腎損害的發生發展及預后有著密不可分的關系[8]。JAK是一種生長調節因子,主要由活化的T淋巴細胞和單核巨噬細胞分泌[9]。OSM具有多種生物學功能,如促進和抑制炎癥反應,促進組織修復再生,刺激造血,調節細胞生長及分化等。OSM也可廣泛作用于體內外各種細胞,表現出多種生物學活性。由于OSM與白細胞介素6家族成員中的白血病抑制因子(LIF)在結構和功能上十分接近,研究證實,OSMR I型為OSM與LIF所共用。有研究報道OSM/OSMR參與調節急性腎功不全腎小管急性損傷,是腎小管急性炎癥反應的重要預測指標。該研究還發現OSM能通過上調LIF/LIFR促進腎小管上皮細胞修復[10]。除此之外,最近體外研究亦發現OSM/OSMR能通過激活Jak/Stat及ERK1/2信號通路誘導人腎小管上皮細胞間充質轉分化參與腎間質纖維化。近年來國內外研究報道OSM及其受體OSMR參與多種腎臟疾病的發生及發展[11]。目前相關的研究發現參與此通路的細胞因子眾多,本課題組通過建立高脂血癥大鼠模型,12周時測大鼠血清總膽固醇、甘油三脂及24 h尿蛋白定量較對照組明顯升高,而內生肌酐清除率未見明顯差異;腎臟病理HE及PAS染色提示腎小球系膜細胞增殖明顯,系膜基質增多,腎小管上皮細胞濁腫,腎間質可見以巨噬細胞為主的炎性細胞大量浸潤,這些和既往國內外報道的脂質腎損傷病理改變一致。JAK/STAT信號通路參與多種生物學過程,如細胞增殖、分化及免疫調節等。該信號通路的傳遞過程主要由3部分組成,即酪氨酸激酶相關受體(receptor tyrosine kinases,RTKs)、酪氨酸激酶JAK和轉錄因子STAT。作為重要的信號轉導與轉錄因子,STATs參與了多重生物學過程,如細胞分化、免疫、應答機胚胎發育等,其中包括STAT1、2、3、4、5a、5b和6這7個成員[12]。STAT3具有2個酪氨酸磷酸化位點(Y701和705)和1個絲氨酸磷酸化位點(S727),SH2結構域能特異性識別磷酸化酪氨酸殘基,從而使含有該結構域的蛋白質定位于酪氨酸磷酸化位點。STAT3可被受體相關的Janus激酶磷酸化,形成同源或異源二聚體,并易位至細胞核[13]。STAT3通過其特殊的SH2結構域與受體上的磷酸化酪氨酸殘基結合,并在JAK激酶的作用下實現其C端酪氨酸殘基的磷酸化,進而啟動一系列的信號轉導,最終導致基因表達或其他細胞學反應[14]。本實驗中通過ELISA方法檢測到高血脂血癥大鼠血清中OSM大量分泌,同時免疫組化法提示腎小管上皮細胞大量表達OSM,而組織蛋白印跡法進一步證實,高脂血癥大鼠腎臟組織中大量表達p-JAK2,p-STAT3,上述結果均提示JAK2/STAT3信號通路活化可能參與在脂質腎損害過程中。

回去后，馬麗亞跟海力發生了爭吵。為了把竹韻從海力身邊推開，她暗暗慫恿自己的親信散布流言蜚語，說竹韻勾引老板，一場老板跟員工的緋聞就這樣有聲有色地掀了起來……

本實驗除發現高脂血癥可誘導SD大鼠腎小球系膜細胞增殖,腎小管-間質炎性細胞浸潤及腎小管上皮細胞濁腫等腎臟損傷和國內外報道一致外,更重要的是p-JAK2/p-STAT3在高脂血癥大鼠腎臟組織中大量表達,STAT3磷酸化后進一步啟動下游信號轉導,從而參與脂質腎損害病理過程,進一步推測OSM可能是其上游因子參與該過程,但尚需要體外實驗進一步證實,以期為脂質腎損害發病機制提供新的倫理依據。