達格列凈對糖尿病大鼠睪丸損傷的保護效應

梅志杰,楊慧娟,陳夢杰,郭園園,潘 艷,徐 宇,孫 妍,梁金寶,楊小淮*

(1蚌埠醫學院第一附屬醫院泌尿外科,蚌埠 233000;2蚌埠醫學院第一附屬醫院腎內科;3蚌埠醫學院生命科學學院;4蚌埠醫學院臨床醫學院;*通訊作者,E-mail:yxhyhr@163.com)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種慢性代謝性疾病,主要特點表現為血糖異常升高,從而引起嚴重的并發癥,2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是糖尿病的常見形式,主要占糖尿病病例的90%[1,2]。根據最新數據統計證實:目前全球大約有5億人罹患糖尿病,到2045年,全球糖尿病患者人數將達到7億左右,盡管對于糖尿病診斷和治療愈發完善,但目前糖尿病仍是巨大的醫療負擔[3]。近年來,糖尿病引起的男性生殖功能異常引起人們的廣泛關注,流行病學研究表明90%的糖尿病患者會出現生育功能紊亂[4]。糖尿病患者男性不育率較高,可能是由于持續的高血糖刺激,炎癥反應及氧化應激影響生殖器官、細胞及生殖激素等[5-7]。作為炎癥反應的重要組成部分,已有研究證實NLRP3炎性小體通路參與了糖尿病的發生及發展過程[8,9]。

鈉-葡萄糖轉運蛋白2(sodium-glucose cotransporter 2,SGLT-2)抑制劑是近年來上市的新型降糖藥物,廣泛用于T2DM的治療,達格列凈是SGLT-2抑制劑的一種。研究證實,達格列凈(dapagliflozin)通過降低血糖、血壓、甘油三酯及胰島素抵抗發揮對腎臟、心臟等保護效應[10-12]。Ye等[13]研究證實達格列凈可以降低NLRP3炎性小體的表達,從而保護糖尿病所造成的心臟損害,隨后Birnbaum等[14]亦證實了達格列凈抑制NLRP3炎性小體的表達對腎臟具有保護作用。近年來越來越多的研究證實達格列凈亦可以通過抑制氧化應激反應來降低糖尿病的風險[15,16]。但達格列凈是否對糖尿病誘導的睪丸損害具有保護效應尚未有報道,故本實驗通過建立2型糖尿病模型,觀察糖尿病大鼠睪丸損害情況,并用達格列凈干預,觀察其對睪丸是否具有保護作用并探討具體機制,為開發出藥物新用途提供理論依據和實驗支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠,清潔級,8周齡左右,體質量200-220 g,購買于蚌埠醫學院實驗動物中心,生產許可證號:SCXK(豫)2019-0002。大鼠飼養于溫度、濕度適宜的動物房,并進行12 h明暗循環,自由進食、飲水。本研究嚴格按照蚌埠醫學院倫理委員會要求進行(批準號:2020-227)。

1.2 實驗材料

鏈脲佐菌素(STZ)購于北京索萊寶公司,達格列凈購于阿斯利康中國制藥公司,丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、蘇木精伊紅染料均購于上海碧云天生物技術公司,Trizol購于美國Invitrogen公司,逆轉錄試劑盒購于美國Thermo Scientific公司,RT-PCR試劑盒購于日本Takara公司。NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α、TGF-β1和GAPDH引物均由上海生工生物工程公司所合成,序列見表1。

表1 用于RT-PCR分析的引物序列

1.3 實驗方法

1.3.1 T2DM模型的建立及干預方式 大鼠適應性喂養1周后,隨機分為正常組(NC組,n=6)和T2DM模型組(n=12)。正常組喂食基礎飼料;T2DM模型組喂食高糖高脂飼料[17](67%基礎飼料、10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、0.5%膽酸鈉),喂養4周后,禁食12 h,T2DM模型組一次性腹腔注射45 mg/kg的STZ,正常組則腹腔注射等劑量的枸櫞酸緩沖液進行對照。72 h后尾靜脈采血測量空腹血糖(FBG),以空腹血糖≥16.7 mmol/L確定為T2DM模型建立成功。將建模成功的大鼠分為T2DM組和達格列凈組(Dap組),用0.5%的羧甲基纖維素鈉將達格列凈片劑配制成1 mg/ml的溶液,灌胃劑量為每天10 mg/kg[18],正常組和T2DM組則灌以等量的羧甲基纖維素鈉溶液。連續灌胃8周后,處死大鼠,收集血液、睪丸。

1.3.2 空腹血糖及血睪酮的檢測 禁食12 h后,用2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,將大鼠置于解剖臺,打開腹腔后腹主動脈采血留取血標本,于全自動生化分析儀上檢測空腹血糖及血睪酮(testosterone)含量。

1.3.3 睪丸組織病理學檢測 按照上述方法處死大鼠后,取出睪丸組織,在預冷PBS中沖洗2遍后濾紙吸干并稱重,計算睪丸質量系數,睪丸質量系數(TW/BW)=(睪丸質量/大鼠體質量)×100%。一側睪丸保存于-80 ℃冰箱用于后續氧化應激及RT-PCR檢測。另一側睪丸則用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋后,切片進行HE染色,至少由2位資深病理專家于顯微鏡下讀片,觀察睪丸組織生精小管及各層生精細胞改變情況。

1.3.4 睪丸MDA和SOD指標的檢測 稱取30 mg睪丸組織,加入300 μl PBS,制備10%的睪丸勻漿液。4 ℃,12 000g將勻漿液離心15 min,收集上清,BCA測定勻漿液濃度后,按照試劑盒所述比色法檢測MDA及氮藍四唑(NBT)顯色法檢測SOD含量。

1.3.5 RT-PCR檢測睪丸組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α、TGF-β1 mRNA的水平 通過Trizol試劑從睪丸組織中提取總RNA。用逆轉錄試劑盒將2 μg總RNA逆轉錄成cDNA。使用SYBR Green Super Mix試劑盒,以2 μl cDNA為模板,總體積為20 μl的體系,條件為:預變性,95 ℃,180 s;以變性:95 ℃,30 s;退火:6 0℃,30 s;延伸72 ℃,15 s,反應45個循環。用PT-PCR儀分析Ct值,用2-ΔΔCt計算目的基因相對表達量。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠一般狀況

除了NC組,T2DM組與Dap組大鼠均出現飲水、飲食增多,小便增多,墊料潮濕,體質量減輕等表現。

2.2 各組大鼠空腹血糖水平

與NC組比較,T2DM組大鼠空腹血糖明顯增多[(7.66±1.54)mmol/Lvs(28.93±2.13)mmol/L,P<0.001];經過達格列凈治療8周后,Dap組大鼠血糖值較T2DM組明顯降低[(28.93±2.13)mmol/Lvs(20.12±3.47)mmol/L,P<0.001,見圖1]。

與NC組相比,***P<0.001,與T2DM組相比,###P<0.001圖1 各組大鼠空腹血糖變化情況Figure 1 Changes of fasting blood glucose(FBG) in rats

2.3 各組大鼠血睪酮水平

與NC組比較,T2DM組大鼠血清睪酮含量明顯降低[(1.62±0.25)μg/Lvs(0.47±0.09)μg/L,P<0.001];經過達格列凈治療后,Dap組大鼠睪酮值較T2DM組明顯增加[(0.47±0.09)μg/Lvs(0.91±0.12)μg/L,P<0.001,見圖2]。

與NC組相比,***P<0.001,與T2DM組相比,###P<0.001圖2 各組大鼠血清睪酮變化情況Figure 2 Changes of serum testosterone in rats

2.4 各組大鼠睪丸質量系數變化

相比于NC組的大鼠睪丸質量系數,造模后T2DM組大鼠睪丸質量系數明顯增加[(0.80±0.10)%vs(1.33±0.13)%,P<0.001];達格列凈干預后,睪丸質量系數較T2DM組明顯下降[(1.33±0.13)%vs(1.00±0.07)%,P<0.001,見圖3]。

與NC組相比,***P<0.001,與T2DM組相比,###P<0.001圖3 各組大鼠睪丸質量系數變化Figure 3 Changes of TW/BW in rats

2.5 各組大鼠睪丸病理學改變

HE染色觀察三組大鼠睪丸組織形態,結果發現:NC組大鼠生精小管中精原細胞核大而圓,貼于基膜內,排列整齊,各級精母細胞層數清晰可見,近管腔側可見大量精子細胞,管腔內充滿精子;T2DM組生精小管形態明顯受損,各級生精細胞減少,層數減少,排列紊亂,腔內精子明顯減少;Dap組精原細胞較T2DM組明顯增多,各級精母細胞層數及數量較T2DM組增多,腔內可見少量精子(見圖4)。這些結果均表明糖尿病可導致睪丸發生病理損害,達格列凈可改善糖尿病誘導的睪丸功能障礙。

黑色箭頭所指為生精細胞;黑色三角形所指為精子圖4 各組大鼠睪丸病理結構變化情況 (HE染色,×200)Figure 4 Pathological changes of the testis in rats (HE staining,×200)

2.6 各組大鼠MDA和SOD水平

結果表明,T2DM組MDA水平較NC組明顯增多(P<0.001),而T2DM組SOD水平較NC組明顯下降(P<0.01)。達格列凈治療后,Dap組MDA水平較T2DM組顯著下降(P<0.001),SOD水平則明顯升高(P<0.05,見圖5)。

與NC組相比,**P<0.01,***P<0.001；與T2DM組相比,#P<0.05,###P<0.001圖5 各組大鼠睪丸MDA和SOD水平Figure 5 The levels of MDA, SOD in the testes of rats

2.7 各組大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α、TGF-β1 mRNA的表達情況

與NC組比較,T2DM組大鼠睪丸組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α、TGF-β1 mRNA的相對表達量明顯增加(P<0.001),達格列凈治療后,Dap組大鼠上述基因相對表達量較T2DM組顯著下降(P<0.01,見圖6)。

與NC組相比,***P<0.001,與T2DM組相比,##P<0.01,###P<0.001圖6 各組大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α、TGF-β1 mRNA的表達水平Figure 6 The levels of NLRP3, ASC, Caspase-1, IL-1β, TNF-α, TGF-β1 mRNA in rats

3 討論

隨著生活方式及生活環境的改變,T2DM已經成為一種全球流行病,其伴隨而來的并發癥對全球健康構成主要威脅。除了人們熟知的心臟、腎臟損害,近年來T2DM所并發的生殖系統損傷引起了人們的廣泛關注[19,20]。持續的高血糖刺激,可以改變精液質量,誘導生精細胞凋亡,破壞血-睪屏障,抑制睪丸激素分泌等,從而損害男性患者生育能力[21,22]。本實驗通過高糖高脂飲食聯合小劑量STZ,破壞胰島β細胞,建立T2DM模型。本研究發現,造模后大鼠出現多飲、多食和多尿等臨床表現,空腹血糖增加,體質量減輕,睪丸質量系數增加,睪丸發生萎縮。組織學結果表明睪丸生精小管發生明顯變化,生精細胞數量明顯減少,血清睪酮值下降,這一系列結果均提示糖尿病刺激導致睪丸功能障礙。

近年來,作為炎性反應重要組成部分,NLRP3/ASC/Caspase-1炎性小體通路與多種炎癥性疾病如痛風、動脈粥樣硬化、糖尿病等關系備受關注,NLRP3炎性小體的激活可以導致活性Caspase-1及IL-1β產生,分泌的IL-1β促進TNF-α、IL-6等炎性因子的分泌,從而增強了機體炎癥反應[23-25]。NLRP3炎性小體通路介導的炎癥反應與氧化應激關系密切,活性氧(ROS)可以激活NLRP3促進組織炎癥并激活免疫反應[26]。越來越多的研究證實氧化應激在T2DM的并發癥中發揮重要作用,MDA是脂質過氧化的重要指標,代表性抗氧化物質SOD可以保護組織免受自由基的損害。動物實驗證實,抑制MDA、增加SOD的產生,可以明顯改善T2DM并發的睪丸損害[27],Liu等[28]亦證實降低NLRP3介導的炎癥反應,對T2DM并發的腎臟具有保護作用。T2DM模型建立成功后,我們觀察到大鼠睪丸組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α的mRNA表達水平明顯增加,提示糖尿病可能激活NLRP3/ASC/Caspase-1炎癥小體通路,引起促炎基因IL-1β、TNF-α的表達量增加,介導睪丸損害,MDA含量增加,SOD含量降低,提示糖尿病可能通過NLRP3炎性體通路介導睪丸組織發生過氧化反應。研究證實,TGF-β1參與調節類固醇的合成、精子的生成與發育等,持續的血糖刺激可誘導TGF-β1大量表達,從而誘導生精細胞凋亡,導致睪丸功能障礙[29,30]。我們發現T2DM組大鼠TGF-β1 mRNA表達水平較NC組顯著增加,并觀察到睪酮水平下降及生精細胞明顯受損。

達格列凈抑制腎小管SGLT-2減少葡萄糖的吸收,促進其排泄,從而獨立于胰島素而降低葡萄糖水平,降糖效果優于其他傳統藥物。學者們發現達格列凈可降低機體炎癥反應、氧化應激等過程,從而改善糖尿病所造成的并發癥損害。動物實驗證實了這一點,達格列凈通過抑制NLRP3炎性小體信號及氧化應激水平來降低糖尿病損害[31]。本研究發現,達格列凈治療后,可明顯降低T2DM大鼠的血糖水平及睪丸質量系數,血睪酮值增加,睪丸生精細胞數量增多,損傷減輕。本研究亦發現,與模型組比較,達格列凈干預后NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α和TGF-β1的表達量明顯下調,過氧化指標MDA明顯下降,抗氧化指標SOD顯著增多,該結果提示達格列凈可能通過抑制NLRP3炎性小體增加機體抗炎癥、抗氧化反應,減輕糖尿病所并發的睪丸損傷。

綜上所述，在T2DM所并發的睪丸損傷中,達格列凈可以降低NLRP3炎性小體,降低睪丸組織發生炎癥反應及氧化應激從而改善糖尿病大鼠睪丸損害,為臨床上治療男性糖尿病生殖系統疾病提供新思路。