UGT1A6（T19G）基因多態性對神經外科預防使用丙戊酸鈉血藥溶度的影響

韓海燕，許銘娟，姬利紅

（河南省鶴壁市人民醫院藥學部，河南 鶴壁 458030）

顱腦創傷后癲癇（Post-traumatic epilepsy，PTE）是顱腦創傷后的嚴重并發癥之一。對于顱腦手術患者圍手術期預防性應用抗癲癇藥物在臨床已經達成普遍共識，認為其有助于降低術后癲癇的發生率，具有應用有效性[1]。丙戊酸鈉（Sodium valproate，VPA）是臨床上最常用的抗癲癇藥物之一，是神經外科圍手術期癲癇預防的首選。丙戊酸鈉有效血藥濃度為50～100 μg/ml，其治療窗較窄，個體差異較明顯[2]。UGT1A3、UGT1A6、UGT1A9 和UGT2B7 等酶均參與了VPA 的葡糖醛酸化過程[3]。UGT 酶對丙戊酸葡糖醛酸化的個體差異可能會影響其藥理作用及生理作用，其基因多態性可影響VPA 的血藥濃度[4-6]。基于此，本研究主要探討UGT1A6（T19G）基因多態性與丙戊酸鈉血藥濃度的關系，以期為制定個體化的丙戊酸鈉藥物治療方案提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入我院神經外科2020 年1 月—2020 年12 月圍手術期預防使用丙戊酸鈉患者55 例，其中男性37 例，女性18 例，年齡18—73 歲，平均年齡（33.1±19.0）歲，平均體重（54.6±19.8）kg。納入標準[7]：①行開顱手術患者；②單藥使用丙戊酸鈉預防癲癇者；③年齡≥18歲者；④體重指數BMI 在18～24 kg/m2；排除標準：①聯合使用可影響丙戊酸鈉血藥濃度等藥物（如碳青霉烯類）者；②既往有癲癇病史者；③肝腎功能異常者。本研究方案經醫院醫學倫理委員會批準，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本采集

所有患者均按醫囑使用丙戊酸鈉，包括丙戊酸鈉口服液（賽諾菲＜杭州＞制藥有限公司，批準文號：國藥準字H20041435，規格：300 ml ∶12 g），丙戊酸鈉片（湖南省湘中制藥有限公司，批準文號：國藥準字H43020874，規格：0.2 g），連續服用丙戊酸鈉5 個半衰期后（約100 h，距最近一次口服藥物8～12 h），于次日晨起給藥前30 min 空腹采集靜脈血3 ml，放置于不加抗凝劑管中，用于丙戊酸鈉血藥濃度測定，另采集靜脈血3 ml 置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中（短期-20℃保存，長期-70℃保存）用于提取DNA。

1.2.2 血藥濃度檢測

所采集血樣置離心機中，以離心半徑8.6 cm，轉速3 000 r/min，離心10 min，取上層血清200 μl 加入VPA試劑盒（德國西門子公司），使用Viva-E 型全自動藥物濃度分析儀（德國西門子公司），采用酶免疫法測定丙戊酸鈉血藥濃度。

1.2.3 基因型檢測

按照DNA 提取試劑盒（美國OMEGA 公司）上說明步驟提取DNA，特異性PCR 引物均由北京六合華大基因科技有限公司設計合成（表1）。PCR 擴增反應體系包括：DNA 1 μl，緩沖液（10×PCR）3 μl，MgCl2（25 mmol）3 μl，dNTP（10 mmol）0.6 μl，引物（10 μmol）1 μl/條，Taq 酶（5 u/μl）0.6 μl，加H2O 至15 μl。PCR反應條件：94℃預變性5 min 后，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，總共35 個循環后，72℃再延伸5 min。純化條件：37℃ 20 min，80℃失活15 min。PCR 擴增產物檢測采用瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件：電壓110 V，電流75 mA。40 min 后觀察結果，要求PCR 擴增產物為單一、清晰的條帶。滿足上述要求后，則進行SNaPshot 延伸反應。

表1 UGT1A6 (T19G) SNP 位點PCR 引物序列

SNaPshot 延伸反應體系：純化后的PCR 產物1 μl，SNaPshot Mix 試劑0.5 μl，延伸引物（10 μmol）0.2 μl/ 條，加H2O 至5 μl。反應條件：94℃預變性1 min 后，94℃變性10 s，52℃退火5 s，60℃延伸30 s，總共35 個循環，最后72℃延伸3 min。取1 μl延伸產物，加9 μl 上樣甲酰胺，96℃變性3 min，立即冰水浴等待測序。

1.3 統計學方法

所有數據采用SPSS 19.0 統計軟件進行分析，計量資料均采用（±s）表示，采用t檢驗或單因素方差分析；計數資料以（n）或（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UGT1A6（T19G）基因型及其分布

UGT1A6 關鍵SNP 位點T19G，其基因頻率符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05），見表2。

表2 UGT1A6(T19G)基因型頻率分布（n，%）

2.2 不同基因型患者基本情況對比

不同基因型患者性別、年齡、體重、日劑量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 不同基因型患者基本情況比較（n，±s）

表3 不同基因型患者基本情況比較（n，±s）

基因型性別年齡（歲） 體重（kg） 日劑量（mg/kg）男女TT 22 12 34.1±18.0 55.8±19.5 17.05±5.58 TG 11 4 30.2±21.7 51.4±17.8 17.98±2.65 GG 4 2 31.0±19.0 49.7±27.6 18.48±7.11

2.3 基因多態性與丙戊酸鈉血藥濃度相關性分析

55 位患者的平均血藥濃度為（70.62±24.72）μg/ml，其中2 例患者血藥濃度＞100 μg/ml，3 例患者血藥濃度＜50 μg/ml。UGT1A6（T19G）突變基因攜帶者TG/GG 丙戊酸血藥濃度顯著低于野生純合型TT 丙戊酸血藥濃度，差異有統計學意義（F=6.015，P=0.003），見表4。

表4 UGT1A6（T19G）基因型與血藥濃度關系[（±s），μg/ml]

表4 UGT1A6（T19G）基因型與血藥濃度關系[（±s），μg/ml]

基因型 標準化血藥濃度 血藥濃度TT 3.76±0.92 75.83±22.01 TG 4.10±0.97 65.82±21.57 GG 5.64±0.88 63.63±27.08

2.4 基因多態性與不良反應之間的關系

55 位患者中有3 例發生胃腸道反應（惡心、腹痛），基因型分別為1 例TT、2 例TG，另有2 例發生肝功能異常（轉氨酶升高），基因型均為TT。5 例中僅1 例肝功能異常者血藥濃度＞100 μg/ml，余血藥濃度均正常。

3 討論

VPA 的給藥劑量往往難以預估，部分患者低給藥劑量時可出現血藥濃度仍超過有效血藥濃度情況。因其不良反應與血藥濃度有一定關系，血藥濃度大于100 μg/ml 可能會引起嚴重的肝毒性及血液系統的不良反應，故使用VPA 時需監測血藥濃度。鳥苷酸二磷酸葡糖醛酸轉移酶（Uridinediphosphate glucuronosyl transferase，UGT）是生物體內外源性物質進行Ⅱ相生物轉化主要的代謝酶。VPA 在進入人體后，約各有40%～50%的VPA 分別經UGT 和線粒體β-氧化代謝。丙戊酸通過UGT 酶代謝成丙戊酸葡糖苷酸，經腎臟排泄[8]。UGT1A6(T19G)位點較新，其基因位點有GG、TT、TG 三種基因多態性。近年來有研究表明，UGT1A6 基因突變可以影響丙戊酸的代謝。因此，了解UGT1A6 基因多態性與丙戊酸鈉血藥濃度的關系對制定個體化的丙戊酸鈉藥物治療方案具有重要意義。

3.1 基因型分布頻率分析

在丙戊酸Ⅱ相代謝中，最主要的酶為UGT 酶，編碼UGT 酶的基因有2 個家族UGT1、UGT2，UGT1 中UGT1A6 和UGT1A9 基因在人肝組織中高表達，其基因多態性可影響丙戊酸鈉血藥濃度[9]。本研究通過對UGT1A6（T19G）進行多態性分析，得到患者UGT1A6（T19G）位點的基因頻率分別為75.46%、24.54%，通過Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗表明研究資料具有群體代表性。其基因突變率為24.54%，與文獻報道的亞洲人群的23.80%接近[10]，可信度較高。此外，本研究發現各基因型患者性別、年齡、體重、日劑量均無統計學差異，提示基因型分布與臨床特征無明顯相關性。

3.2 基因型對血藥濃度的影響

本研究結果表明，基因位點UGT1A6（T19G）不同基因型可影響VPA 血藥濃度。本研究中55 例入組患者均服用常規劑量VPA，其中2 例血藥濃度超安全范圍，基因型均為野生純合型TT，可能與UGT1A69（T19G）基因突變導致其代謝所需酶活性增高，導致丙戊酸從體內清除加快有關[10]，因而突變型基因患者可能需要更高劑量以達到有效血藥濃度。因VPA 藥物療效與血藥濃度呈相關性，VPA 超安全治療范圍，其不良反應發生率可能提高[11]。通過本研究可知，UGT1A6（T19G）其野生純合型TT 基因攜帶者血藥濃度要顯著高于其突變型TG+GG 基因攜帶者，建議基因型TT 的患者服用VPA 時可酌情減少給藥劑量，基因型為TG 或GG 的患者服用VPA 時可遵循說明書用量或酌情增加劑量。

3.3 基因多態性與不良反應分析

VPA 常見不良反應有肝功能異常、胃腸道反應、神經系統癥狀等，其中肝功能異常發生率最高，可達15%～30%[2]。有文獻報道[12]，VAP 肝毒性與CYP2C9酶活性有關，但與UGT 酶活性相關性尚無報道。本研究中55 例患者中發生不良反應者5 例，2 例為肝功能異常，總體來看不良反應發生人數較少，且基因型包含TT、TG。但目前關于UGT1A6（T19G）不同基因型對不良反應的影響不明確，有待擴大樣本后進一步研究。

3.4 總結與不足

影響VPA 患者血藥濃度的因素是多方面的，包括VPA 的劑型、給藥劑量、正確的采血時間、基因多態性及藥物相互作用等。本研究排除藥物相互作用及給藥劑量超說明書等因素，但不排除采血時間的差異等人為因素。若同時給予同一生產廠家同一劑型藥品，同一時間采血，患者血藥濃度仍差異較大，則可能為基因多態性影響其血藥濃度。另該研究樣本量有限，不良反應發生例數少，UGT1A6（T19G）基因多態性對VPA 血藥濃度及不良反應的影響仍需擴大樣本進一步研究。

綜上所述，UGT1A6（T19G）基因多態性影響患者丙戊酸鈉血藥濃度，其基因突變攜帶者可能需要更高劑量的丙戊酸鈉。