大觀霉素菌種選育的原生質體

徐婷婷

摘要：本文將5-48號菌株作為出發菌株、得到原生質體，展開針對性的處理，獲取得到高產菌株7-23，通過對兩種菌株的對比分析，對大觀霉素菌種選育的原生質體—再生技術展開具體論述，旨在全面提高菌株生產能力，為今后大觀霉素菌種選育打下堅實基礎。

關鍵詞：大觀霉素;原生質體;再生技術

引言：大觀霉素作為氨基環醇類抗生素的一種，通過壯觀鏈霉菌制備而成，在臨床上主要用于治療急性淋病，還可以將大觀霉素用于農藥噴灑，治療效果突出且明顯，使用安全且穩定。

1.大觀霉素菌種制備和發酵

對于原生質體-再生技術，無論是在慶大霉素、吉他霉素，還是在螺旋霉素、泰樂星的菌種培育中都能夠起到良好的應用效果。對于大觀霉素，壯觀鏈霉菌作為產生菌、原菌種號額設置為47號，通過分離操作獲取得到7-23號。在恒溫作用下一共培養8～10天，通過三級振蕩培養，將其放置到瓶中用于檢測生物效價。較為典型的大觀霉素菌種制備和發酵工藝主要表現為：第一，在原始細胞庫冷凍孢子。第二，在工作細胞庫冷凍孢子。第三，進行一定時間段的斜面孢子培養。第四，種瓶培養。第五，展開一級種子液培養工作。第六，二級種子液培養工作。第七，定期進行發酵液的組織培養。大觀霉素生物效價測定方法則采用管碟法進行，而大觀霉素試驗指示菌則為肺炎克雷伯氏菌。

2.大觀霉素的選育方法

現有的大觀霉素菌種選育方法主要包括以下幾種，第一種即為誘變育種，作為一種較為傳統的菌種育種方式，應用時間長、應用范圍廣、應用價值高，將其與其他誘變方法相結合，還能夠顯著提高誘變效果、促使產物具有高抗性。但是需要注意的是，采用誘變育種方法本身的隨機性影響很大，采用誘變育種很容易促使最終生成的菌株難以達成目標要求，自身性能出現缺陷，甚至生成變異株[1]。第二種是原生質體育種，原生質體育種方法的應用原理便在于充分利用原生質體，在沒有細胞壁的影響下，整個誘變處理過程更加簡單方便，誘變效益也更加突出、正突率幾率也能夠顯著提高。與此同時，對于原生質體育種，無論是生成原生質體，還是再生原生質體，都能夠直接進行分離純化菌種，質體突變的可能性也會相應提高。

3.原生質體制備和處理

3.1原生質體制備

對于大觀霉素原生質體的制備工作，需要預先準備好新鮮母瓶，具體規格為0.5%甘氨酸、3粒玻璃珠，一共需要培養42小時。需要預先提取出10ml，并按照2500r/min的轉速進行離心處理10分鐘，棄上清液。之后，需要清洗緩沖液2次，并按照3000r/min的轉速進行離心處理10分鐘，棄上清液，最終制備得到酶解用菌體。

3.2酶解

對于已經清洗完成的濕菌體，需要相應添加容量為8ml、濃度為4mg/ml的雞蛋清溶菌酶。整個酶解過程如果發現酶解中的菌絲體懸液在較短時間內就開始變清，則表示已經形成大量原生質體。并準備好顯微鏡進行具體觀察，一旦發現較多數量、較大面積的亮點，則表示已經終止酶解環節，實現大量原生質體的釋放工作。

3.3紫外線誘變處理

對于紫外線誘變處理原生質體，需要預先準備好經過上述處理的原生質體懸浮液，原生質體懸浮液容量為5ml，并將其直接移置到9cm定量培養皿，工作人員輕輕進行懸浮液的攪動，促使其能夠處于紫外線照射下，照射時間控制在90s。當原生質體懸浮液適當稀釋之后，則需要在溫度為28℃的分離再生培養基直接培養7天左右，從而完成整個原生質體的紫外線誘變處理[2]。

4.試驗結果分析

4.1菌株單菌落考察情況

對于大觀霉素的菌種選育，菌落形態一共有三種，分別是梅花型、饅頭型帶紅邊以及草帽型，搖瓶效價則分別為230μg/ml、230μg/ml、220μg/ml。按照不同菌落形態展開正交試驗，將影響因素分別設置為單菌落形態、單菌落生長周期、單菌落直徑大小。其中，當影響因素為單菌落形態，將A1、A2、A3分別設置為梅花型、饅頭型帶紅邊、草帽型。當影響因素為單菌落生長周期，將B1、B2、B3分別設置為10天、9天、8天。當影響因素為單菌落直徑大小，將C1、C2、C3分別設置為3.0mm、3.5mm、4.0mm。通過正交試驗最終獲取得到最佳組合結果為A2B3C2，也就是優選菌落為單菌落形態為饅頭型帶紅邊、單菌落生長周期設置為8天、單菌落直徑大小設置為3.5mm。

4.2 7-23號菌株初篩、復試、放大結果

7-23號菌株和對照菌株5-48相比，復試結果超過22%。當其處于18m3的發酵罐中，7-23號菌株和對照菌株5-48相比，放大結果超過17%。

事實上，對于新菌株7-23，和對照菌株5-48相比，搖瓶效價顯著增加，新菌株7-23菌種號從1到10的平均值為255μg/ml、對照菌株5-48菌種號從1到10的平均值為209μg/ml。對于新菌株7-23在18m3發酵罐放大結果，和對照菌株5-48相比，新菌株7-23菌種號從1到9的平均值為279μg/ml、對照菌株5-48菌種號從1到9的平均值為238μg/ml。與此同時，所有質檢結果均合格，整個菌株的生產代謝過程較為平穩正常，對今后進行實際生產作業也具有重要意義。

需要注意的是，對于已經誘變完成后的菌株，菌落形態多樣，不同的菌落形態搖瓶效價也存在明顯差別，在梅花型、饅頭型帶紅邊、草帽型三種菌落形態中，搖瓶效價最高的則為饅頭型帶紅邊的菌株。現階段，單菌落進罐則是一種應用較為廣泛的菌種類別，無論是搖瓶效價，還是發酵水平都較為穩定。

結論：綜上所述，對大觀霉素菌種選育的原生質體—再生技術展開分析具有至關重要的意義。經5-48號菌株酶解、誘變處理后的7-23號菌株的搖瓶效價和18m3發酵罐菌株生產能力都顯著提高。今后，也應當不斷加強技術研究，著力形成更具有可行性和規范性的生產工藝，促使大觀霉素能夠充分發揮自身應用效能。

參考文獻：

[1]王麗霞，孟慶娟，李生龍，等.鹽酸大觀霉素高效液相色譜檢測方法的建立[J].安徽農業科學，2020，48（19）：198-202.

[2]丁麗軍，沈建新，陳長寬，等.氣相色譜-串聯質譜法檢測豬肉中大觀霉素和林可霉素殘留量[J].揚州大學學報（農業與生命科學版），2019，40（06）：93-99.