卷曲霉素產生菌的改良研究

蘆安娜

摘要：以卷曲霉素產生的菌卷曲鏈霉菌作為出發菌，經過UV誘變和五氯酚濃縮處理，得到一株效價在7950u/ml左右的營養缺陷型卷曲霉素菌株，再經過EMS誘變處理篩選得到更多突變株和高產菌，整個過程中卷曲霉素的效價都能保持在穩定的狀態。采用單因子實驗與多因子正交實驗進行分析，經過研究確定卷曲霉素菌株N13最佳發酵條件，此時卷曲霉素效價達到了9483u/ml，比出發菌的效價提升了42.8%以上。

關鍵詞：卷曲霉素;卷曲鏈霉菌;結核桿菌;發酵生產;菌種改良

引言：卷曲霉素主要是由卷曲鏈霉菌產生的環狀多肽類抗生素，對結核桿菌傳染引發的肺結核有著較好的治療效果，且副作用比較小。目前卷曲霉素已成為較為理想的抗結核菌藥物，由于其發酵效價成本低，成藥價格略高，有必要對卷曲霉素產生菌進行有效的改良與分析，經過物理或化學誘變劑處理方法做出改良，并得到理想化實驗結果。

1.卷曲霉素的研究現狀

卷曲霉素簡稱CPM，是由卷曲鏈霉菌或指孢囊菌產生，類似于紫霉素的環狀多肽類抗生素，卷曲霉素中的組份十分相似，可以溶于水，但無法溶于多數有機溶劑，卷曲霉素在酸堿度4-8的水溶液中比較穩定，其抗菌機理是抑制細菌蛋白質的合成。當前人們將卷曲霉素用于抗結核桿菌感染，這是有效控制耐藥性結核疾病的重要抗生素，隨著肺結核抗菌素的研制成功，肺結核已經基本得到控制，但近年來該疾病再次蔓延，世衛組織于1993年宣布肺結核為全球性急癥，1996年將4月24日定為世界防治結核病日[1]。

2.卷曲霉素產生菌的改良研究

2.1材料與方法

2.1.1菌株與試劑

卷曲霉素產生菌的改良試驗主要用到兩種菌株，一種是出發菌株卷曲鏈霉素4006，另一種是檢測菌枯草芽孢桿菌6633，這兩種菌株目前都由中國科學研成都生物所負責保存。

本實驗使用到的方法主要有以下幾種：（1）紫外線誘變篩選。紫外線誘變就是將出發菌卷曲鏈霉素在高氏一號斜面培養基中培養10天左右，溫度控制在28℃，使用無菌生理鹽水洗下孢子，再用玻珠搖勻，制作為每毫升106個孢子懸液。取下50ml的孢子懸液，將其放在500ml燒杯內，紫外燈先預熱20min，隨后將燒杯放在磁力攪拌器上，用40w燈在距離30cm的位置照射0-5min，分別取樣10ml即可。等待樣品稀釋取0.1ml稀釋液涂布ES平板，在28℃環境下避光培養一周即可，測定卷曲霉素紫外誘變后的存活情況。（2）營養缺陷型篩選。使用無菌牙簽將ES平板上長出的菌落分別點中在基礎平板和ES平板中，并與出發菌4006進行對照分析，每個平板需點中菌落52個，在28℃的環境溫度下培養10天左右。在基礎平板上不長，但是在ES平板上生長的菌落就是營養缺陷型。（3）CPM抑制卷曲鏈霉菌4006實驗分析。

2.1.2培養基

對于實驗中需要用到的培養基，主要有以下幾種：高氏一號培養基，使用蒸餾水定容后到1L，要求酸堿度在7.2左右;種子培養基，其中包含蛋白、玉米淀粉、葡萄糖、碳酸鈣、氯化鈉、氫氧化鈉等，用蒸餾水定容，酸堿值達到7.2;發酵培養基，主要用于卷曲霉素初篩和復篩，與種子培養基要求相同;NO.13與NO.39培養基，前者需要將20g的掩埋在1L蒸餾水內煮沸20分鐘，紗布過濾后加入18g瓊脂，補充蒸餾水到1L，調整酸堿值為7.2，再加入1ml微量元素溶液。NO.39培養基中包含葡萄糖、麥芽酚、碳酸鈣、瓊脂以酵母膏，加入蒸餾水后還需使用KOH調整PH值。

2.1.3原生質體NTG誘變

首先，培養菌絲體生長。將出發菌孢子使用生理鹽水洗下，玻璃珠搖勻后接入盛裝25mlPM1培養液的三角瓶內，要求溫度控制在30℃，每分鐘150r勻速培養24小時。其次，制備原生質體，最終溶菌酶的濃度應達到1g/L，在搖床上保持每分鐘100r的速度，35℃下酶處理60分鐘。最后，NTG誘變原生質體，取10ml離心管，共3支，分別加入4ml原生質體懸液，再加入NTG，洗滌后制作原生質體溶液并涂布在平板上，30℃的溫度下培養一周，最終確定原生質體再生頻率。

2.1.4篩選卷曲霉素高產菌

初步篩選時使用瓊脂塊法，復篩使用搖瓶發酵法，將斜面上生長好的孢子接種在25ml種子培養液內，在250ml三角瓶中以每分鐘240r的速度培養48小時，種子長好以后再以10%的接種量，將其接種在25ml發酵培養液內，同等培養條件培養96小時。

2.2研究結果

2.2.1獲得營養缺陷型高產菌

取經過紫外線誘變5分鐘，致死率94%，且經過五氯酚處理后的卷曲霉素孢子懸液涂布在ES平板中，再從菌落中篩選出營養缺陷型4株，經過瓊脂法和搖瓶發酵的篩選方法，從缺陷型菌株中篩出卷曲霉素效價在7950u/ml的營養缺陷型高產菌，其突變株產量比出發菌4006產量高出19.7%[2]。

2.2.2獲得抗終產物CPM高產菌

取經過EMS誘變2分鐘且致死率在74%的出發菌4006的孢子液，涂布在ES平板內，平板中含有CPM，挑取290株CPM突變株，使用瓊脂塊法經過初篩后發現抑菌圈大于出發菌，搖瓶發酵進行復篩，得出抗性突變株5-41，與4006-35株相比產量提高了6.4%。所以抗終產物CPM突變株5-41可以作為下一輪原生質體NTG誘變出發菌株。

2.2.3NTG誘變原生質體篩選高產菌

再生平板中的原生質體占比92%，使用NTG溶液誘變原生質體30分鐘，篩選出卷曲霉素高產菌，挑選出出高產菌后還需經過初篩與復篩，發現沒有得到超過出發菌5-41的菌株，經過NTG誘變CPM抗性突變株原生質體再生菌落內選730株做初篩與復篩，最終得到了9050u/ml突變株N13，與出發菌5-41相比產量提高了7.2%。

總結：總而言之，當前人們加深了對微生物遺傳學的研究深度，有目的的篩選出了與產品質量和數量相符合的突變型菌株，避免了以往篩選工作的盲目性。本文采用篩選營養缺陷型突變株的方法得到了卷曲霉素高產突變菌株，在達到卷曲霉素高產菌朱目的的同時為后續結核菌的抑制奠定了基礎。

參考文獻：

[1]李桂蓮，萬康林.5種中國罕見慢速生長非結核分枝桿菌標準株及臨床分離株的藥物敏感性分析[J].疾病監測，2020，35（05）：435-441.

[2]許磊.觀察卷曲霉素在耐多藥肺結核治療中應用價值并分析用藥安全性[J].人人健康，2020（08）：223-224.