黃芪皂苷II調控CD45 PTPase誘導抗腫瘤免疫效應的研究*

王 敏，鄭 喜，普曉佳，萬春平△

（1.云南省第一人民醫院急癥醫學部，云南 昆明 650032；2.云南中醫藥大學第一附屬醫院，云南 昆明 650021；3.云南中醫藥大學中藥學院，云南 昆明 650500）

補益中藥黃芪具有健脾補中、升陽舉陷、益衛固表、利尿、托毒生肌之功效，中醫臨床上常配伍應用于免疫低下癌癥患者，以達到增加療效、減輕毒副反應的效應[1-2]。現代研究表明，傳統黃芪主要活性成分之一—黃芪皂苷具有廣泛的生物活性，其中包括抗腫瘤和免疫調節，然而其抗腫瘤免疫作用機制不明確[3-5]。最新研究已證實，T淋巴細胞介導的免疫功能在抗腫瘤免疫中發揮關鍵作用，T細胞既是免疫應答的主要調節細胞，又是免疫功能的執行者，T淋巴細胞執行的免疫監視功能在機體防疫腫瘤的發生與發展發揮關鍵作用。因此，如何提高機體的抗腫瘤免疫，尤其是T淋巴細胞功能，對于腫瘤患者的治療至關重要。CD45分子屬于PTPase家族之一，主要表達在淋巴細胞表面，其主要功能傳遞T細胞抗原受體信號，在T細胞活化信號中扮演重要角色，與腫瘤的發生與發展密切相關[6]。在CD45 PTPase篩選模型和細胞模型中，本研究團隊前期發現黃芪皂苷能夠激活CD45 PTPase，誘導Th1細胞介導免疫反應[7-9]。然而在真實的H22荷瘤小鼠病理環境中，黃芪皂苷是否通過激活CD45 PTPase介導抗腫瘤免疫，目前尚未明確，值得進一步研究。本研究以H22荷瘤小鼠為模型，研究黃芪皂苷激活CD45 PTPase干預H22荷瘤小鼠的作用機制，為其臨床應用提供實驗基礎。

1 實驗材料

1.1 動物 8周齡SPF級雌性BALB/c小鼠21只，體質量（18.00±2.00）g，動物由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（湘）2016-0002，動物飼養在云南中醫藥大學第一附屬醫院中心實驗室屏障系統，飼料和水消毒后，給予實驗動物自由攝取。

1.2 主要藥物與試劑 黃芪皂苷II由云南中醫藥大學中藥學院左愛學博士提供，受試藥物呈白色粉末狀，純度>99%，黃芪皂苷II用0.5%羧甲基纖維素鈉做成混懸劑灌胃給藥。Trizol裂解液由天根生化（北京）科技有限公司提供。SYBR Premix Ex TaqⅡ染料和RNA逆轉錄試劑盒來自Takara公司；熒光標記的抗小鼠IL-17A、抗小鼠Foxp3、抗小鼠CD4和抗小鼠IFN-γ抗體均來自美國Biolegend公司；抗小鼠CD45抗體購自 eBioscience；PMA、Ionomycin以及 BFA購自Sigma公司；H22細胞系購自中國科學院昆明動物研究所。

1.3 主要儀器 Canto II流式細胞儀由美國BD公司提供；核酸擴增熒光檢測儀由美國安捷倫公司提供；二氧化碳培養箱購自美國賽默飛世爾科技公司；酶標儀購自美國Molecular Devices公司；離心機購自德國賀利氏儀器公司；PCR基因擴增儀購自美國ABI公司。

2 實驗方法及評價

2.1 H22荷瘤小鼠模型的構建、分組和給藥 復蘇H22細胞株，培養2～3代后，接種在BALB/c小鼠，接種7d后，腹部消毒，抽取腹水，PBS洗2遍，配成濃度為5×106個/mL單細胞懸液，于右側腋下進行接種，體積為0.2 mL。然后隨機分為3個組，即模型組、黃芪皂苷II組和抗CD45抗體+黃芪皂苷II組，每組7只。模型組灌胃給予生理鹽水0.2 mL；黃芪皂苷II組以黃芪皂苷II 30 mg/kg灌胃給藥；抗CD45抗體組+黃芪皂苷II組給藥方式在給黃芪皂苷II組的基礎上，注射抗 CD45 抗體（1 μg/kg），每日 1次，連續 21 d。

2.2 小鼠瘤徑和瘤重抑制率測定 末次給藥后處死小鼠，完整剝離腫瘤，稱重，利用游標卡尺測量長徑（a）和垂直橫徑（b），并根據公式：DT=（a× b）1/2，VT=（a×b2）/2，計算。并計算平均瘤徑（DT）及瘤積（VT），瘤積抑制率。并計算腫瘤抑制率。

2.3 MTT法檢測淋巴細胞的增殖活性 常規制備各組脾淋巴細胞，調細胞濃度為4×106個/mL，接種于96孔板（4×105個/孔），同時加入 2.5 μg/mL ConA 進行刺激，細胞于含5% CO2培養箱中培養48 h，培養結束后，每孔加入 20 μL MTT溶液，繼續培養1～2 h，3 000 r/min離心5 min，貼壁吸去上清液，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩器震蕩溶解藍紫色結晶，酶標儀570 nm處檢測吸光度。

2.4 熒光定量PCR檢測 常規制備脾淋巴細胞，調細胞濃度為 1×107個/mL，離心，PBS洗 2遍，加入 Trizol裂解液1 mL，裂解脾淋巴細胞。參照產品說明書，采用RNA高效總RNA提取試劑盒提取總RNA，然后進行RNA濃度的定量，反轉成cDNA。以轉錄所得的cDNA為模版，取同一份cDNA作為擴增模板，按照SYBR Premix Ex TaqⅡ染料使用說明書，實時熒光定量 PCR 測定 IL-2、IFN-γ、IL-4、T-bet mRNA 表達水平。熒光定量PCR的結果以Ct值顯示。詳細的PCR引物序列如下表：

基因 P C R引物序列 擴增產物長度（b p）I L-2 F o r w a r d 5'-T G A G C A G G A T G G A G A A T T A C A G G-3'R e v e r s e 5'-G T C C A A G T T C A T C T T C T A G G C A C-3'；3 2 0 I F N-F o r w a r d 5'-A T G A A C G C T A C A C A C T G C A T C-3'；R e v e r s e 5'-C C A T C C T T T T G C C A G T T C C T C-3'； 3 3 0 T-b e t F o r w a r d 5'-C C A G G A A G T T T C A T T T G G G A A G C-3'；R e v e r s e 5'-A C G T G T T T A G A A G C A C T G-3' 3 5 8 I L-4 F o r w a r d 5'-T A C C A G G A G C C A T A T C C A C G G A T G-3'；R e v e r s e 5'-T G T G G T G T T C T T C G T T G C T G T G A G-3'；3 6 8 β-a c t i n F o r w a r d 5'-G G C T G T A T T C C C C T C C A T C G-3'；R e v e r s e 5'-C C A G T T G G T A A C A A T G C C A T G T-3'； 3 4 6

2.5 流式細胞術檢測 流式細胞術檢測參照文獻[9-10]。簡言之，分離各組脾淋巴細胞，與PMA、Ionomycin和 Brefeldin A于 37℃ 5% CO2培養 4 h。收集細胞，阻斷非特異性結合，行細胞表面標志染色，固定、穿模，加入APC anti-mouse IL-17A和FITC anti-mouse IFN-γ抗體，流式細胞儀收集細胞，Flowjo軟件分析。對于Foxp3胞內熒光染色，按照胞內染色方法染色，無需上述刺激，流式細胞儀收集細胞和分析。

3 實驗結果

3.1 黃芪皂苷II對H22荷瘤小鼠抗腫瘤效應的影響抗腫瘤療效結果見表1，ASI II干預組小鼠瘤重、瘤徑（DT）及瘤積（VT）均顯著低于模型組，差異具有顯著性意義（P<0.05）。抗CD45 Ab+ASI II組小鼠瘤重、瘤徑（DT）及瘤積（VT）高于單一 ASI II干預組，其中與模型組差異無顯著性意義，提示CD45抗體干預能部分取消ASI II抗腫瘤效應。

表1 黃芪皂苷對H22荷瘤小鼠抗腫瘤效應的影響（±s，n=7）

表1 黃芪皂苷對H22荷瘤小鼠抗腫瘤效應的影響（±s，n=7）

注：與荷瘤模型組比較：*P<0.05；與ASI II組比較：#P<0.05。

組別 劑量/(m g·k g-1)荷瘤模型組 -瘤重/g 0.7 9±0.1 5 A S I I I組 3 0 m g/k g 0.4 5±0.1 0*C D 4 5 A b+A S I I I 1 g.m g/k g+3 0 m g/k g 0.7 8±0.1 5#D T V T 7 4.3 1±9.4 3 1 0 2 3±1 1 9 5 5.9 3±1 2.4 3* 6 6 0±2 2 3*7 4.3 9±1 0.5 8# 9 9 6±1 9 8#

3.2 黃芪皂苷II對腫瘤模型小鼠T淋巴細胞增殖活性影響 圖1結果顯示，在無絲裂原ConA刺激培養條件下，ASI II干預組顯著提高淋巴細胞的增殖功能。抗CD45抗體干預對ASI II促進淋巴細胞的增殖功能無明顯影響。在ConA刺激條件下，ASI II干預組淋巴細胞增殖活性高于荷瘤模型組，差異有顯著性意義（P<0.05）。抗CD45 Ab+ASI II組小鼠脾臟對ConA誘導的T細胞增殖反應降低，與ASI II干預組比較，差異具有顯著性意義（P<0.05）。

圖1 黃芪皂苷II對H22荷瘤小鼠T淋巴細胞增殖的影響

3.3 黃芪皂苷II對H22荷瘤小鼠Th1/Th2細胞因子及轉錄因子mRNA的影響 熒光定量PCR檢測結果表明，與H22荷瘤模型組比較，在轉錄水平，ASI II干預顯著促進Th1細胞因子（IL-2、IFN-γ）及特異性轉錄因子T-bet mRNA表達，差異均有統計學意義（P<0.05）。抗CD45 Ab+ASI II組小鼠淋巴細胞IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA低于ASI II藥物干預組，其中IL-2和IFN-γ差異具有統計學意義（P<0.05）。ASI II藥物干預顯著提高Th2細胞因子（IL-4）mRNA表達，抗CD45 Ab干預部分取消ASI II促Th2細胞因子（IL-4）mRNA 表達（P<0.05），結果見圖 2。

圖2 黃芪皂苷II對H22荷瘤小鼠Th1/Th2細胞因子及轉錄因子mRNA的影響

3.4 黃芪皂苷II對H22荷瘤小鼠淋巴細胞Treg細胞比例的影響 Treg細胞染色結果如圖3結果所示，黃芪皂苷II組小鼠脾淋巴細胞中CD4+Foxp3+調節性T細胞比例低于模型組（P<0.05）；與模型組比較，抗CD45 Ab+ASI II組小鼠脾淋巴細胞中CD4+Foxp3+調節性T細胞無明顯變化，說明CD45 Ab干預無法有效阻斷ASI II誘導的Treg下調作用。

圖3 黃芪皂苷II對H22荷瘤小鼠淋巴細胞Treg細胞比例的影響

3.5 黃芪皂苷II對H22荷瘤小鼠脾淋巴細胞Th1細胞（IFN-γ）比例的影響 細胞因子胞內染色結果如圖4結果所示，黃芪皂苷II組小鼠脾淋巴細胞CD4+IFN-γ+T細胞比例顯著高于模型組（P<0.05）；與黃芪皂苷II組比較，CD45 Ab+ASI II組小鼠脾淋巴細胞中CD4+IFN-γ+T細胞比例顯著降低（P<0.05）。

圖4 黃芪皂苷II對H22荷瘤小鼠淋巴細胞Th1細胞（IFN-γ）比例的影響

提示在荷瘤病理環境中，CD45抗體阻斷了ASI II誘導Th1細胞免疫反應。

4 討論

CD45分子屬于跨膜蛋白酪氨酸磷酸酯酶家族成員之一，研究已證實：CD45分子通過激活胞質區PTPase的活性，在T細胞活化信號中扮演重要角色，與腫瘤的發生與發展密切相關。因此CD45分子已成為抗腫瘤免疫藥物篩選重要靶點[6]。

體內、外抗腫瘤研究結果已表明，ASI II體外細胞實驗對腫瘤細胞增殖無明顯影響，體內灌胃給藥對小鼠移植性腫瘤H22和S180的生長具有抑制作用，促進荷瘤小鼠免疫抑制功能的恢復[5]。在原發性肝癌肺轉移模型組，ASI II藥物干預顯著抑制抗肺轉移效應，促進Th1細胞因子釋放及T淋巴細胞的激活[9]。這些研究結果提示，黃芪皂苷抗腫瘤作用機制與增強機體抗腫瘤免疫效應有關，但具體的抗腫瘤免疫分子機制尚未明確。基于ASI II激活CD45 PTPase前期研究結果，我們提出“黃芪皂苷調控CD45蛋白酪氨酸磷酸酯酶介導抗腫瘤免疫作用”的科學假設。通過腋下注射H22腫瘤細胞，我們構建了H22荷瘤腫瘤模型，模擬真實荷瘤的免疫環境，以CD45抗體為研究工具，進一步闡明ASI II通過調控CD45 PTPase信號通路介導抗腫瘤免疫作用的新機制。本研究結果顯示，黃芪皂苷具有顯著抗腫瘤效應，促進模型小鼠脾淋巴母細胞增殖。在機體的抗腫瘤免疫反應中，T淋巴細胞發揮關鍵作用，尤其是Th1細胞免疫反應。輔助性Th1細胞激活主要分泌IFN-γ、IL-2等細胞因子，誘導機體的抗腫瘤免疫反應。本研究結果顯示，ASI II促進荷瘤小鼠脾淋巴細胞Th1細胞免疫反應，包括上調IL-2和IFN-γ mRNA的表達和CD4+IFN-γ+h1細胞比例。而ASI II+CD45抗體組脾淋巴細胞的增殖活性、細胞因子IL-2和IFN-γ mRNA表達顯著均低于ASI II單一組。結果提示，在荷瘤病理免疫環境中，黃芪皂苷II可能通過調控CD45 PTPase誘導Th1細胞反應。

T-bet是屬于T-box家族的轉錄因子，屬于Th1細胞特異轉錄因子，特異調控Th0細胞向Th1細胞趨向性分化，對輔助性Th1特異分化起著決定作用[12-13]。為明確黃芪皂苷激活CD45 PTPase如何誘導Th1細胞免疫反應反應，我們進一步采用qPCR檢測Th1細胞特異轉錄因子T-bet mRNA的表達水平。結果表明，ASI II顯著上調H22荷瘤模型小鼠脾淋巴細胞T-bet轉錄水平，CD45抗體減少

ASI II促T-bet mRNA表達，提示黃芪皂苷激活CD45 PTPase誘導Th1細胞免疫反應機制可能與誘導轉錄因子T-bet有關。前期我們在TCR誘導T細胞活化模型和免疫低下模型上，黃芪皂苷II顯著增強Th1型免疫反應，兩者研究結果一致[8]。Treg細胞主要介導機體的免疫耐受，它是機體維持自身內環境穩定的主要免疫調節機制，與抗腫瘤免疫密切相關[14]。流式細胞檢測結果表明，ASI II顯著下調荷瘤小鼠脾淋巴細胞CD4+Foxp3+Treg細胞表達水平，然而CD45抗體干預對Treg細胞比例下降無明顯作用。提示黃芪皂苷II對Treg細胞的調控作用，可能不是通過激活CD45分子介導免疫反應。

總之，該研究證實黃芪皂苷II可能調控CD45 PTPase，促進Th1細胞因子釋放及核轉錄因子的激活，增強抗腫瘤免疫效應。本研究為黃芪抗腫瘤免疫療法和臨床應用提供實驗基礎。