基于PI3K/Akt信號通路探討活血通絡(luò)法對膝骨關(guān)節(jié)炎小鼠細(xì)胞凋亡和相關(guān)蛋白水平表達(dá)的影響*

呂 靜 ，李具寶 ，廖建青 ，何渝煦 ，王 琦 △，李 波

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500； 2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院/云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650021）

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以關(guān)節(jié)腫脹、僵硬、活動受限等為主要臨床表現(xiàn)，具有高致畸率和致殘率的慢性、進(jìn)行性疾病[1-2]。該病患病率與年齡成正相關(guān)，在60歲及其以上的老年人，近一半有骨關(guān)節(jié)炎的X線表現(xiàn)[3-4]。隨著我國人口老齡化的加重，KOA發(fā)病率也隨之上升。目前，KOA病因及病理機(jī)制尚未完全明晰[5]，近年來，信號通路在KOA軟骨細(xì)胞增殖、凋亡和發(fā)病機(jī)制和靶向治療研究方面也逐漸起步[6]，相關(guān)研究表明PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路在KOA發(fā)病機(jī)制中尤為重要，對軟骨細(xì)胞增殖、凋亡有重要的調(diào)控作用[7]。中醫(yī)藥治療KOA獨(dú)特優(yōu)勢日益顯著[8-12]。我院骨傷科在多年的臨床經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)查閱的基礎(chǔ)上，以活血通絡(luò)為治法運(yùn)用骨痹合劑治療膝骨關(guān)節(jié)炎具有良好的療效。經(jīng)前期臨床試驗(yàn)和基礎(chǔ)研究表明[13-14]，以活血通絡(luò)法為治法的骨痹合劑能有效改善軟骨退變中的軟骨基質(zhì)代謝、抑制氧自由基損傷。本研究通過觀察骨痹合劑對小鼠PI3K/AKT通路中關(guān)鍵調(diào)控因子Bad、Caspase-3、Caspase-9和NF-κB的mRNA和蛋白的表達(dá)探討具有活血通絡(luò)作用的骨痹合劑治療KOA的作用機(jī)理，為臨床治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級C57雄性小鼠60只，體質(zhì)量（19.58±0.6）g，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，許可證號：SCXK（蘇）2017-0001。小鼠生長條件為室溫（22±1）℃，相對濕度為38%～48%，每天日照時間為12 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 ①骨痹合劑（滇藥制字（Z）04A01888）由云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院/云南省中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供；②氨糖美辛腸溶片（國藥準(zhǔn)字H44022796）購買于上海華中藥業(yè)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 蘇木素（珠海貝索，批號：BA4097）；伊紅染液（珠海貝索，批號：BA4099）；中性樹膠（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：10004160）；Trizol（Takara，批號：9108）；Nanodrop（Thermo fisher，2000）；DEPC（上海阿拉丁生化，批號：D105557）；RIPA（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0013B）；蛋白酶抑制劑cocktail（瑞士 Roche，批號：4693116001）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（Beyotime，批號：P0010）；鹽酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：7647-01-0）；EDTA抗原修復(fù)液（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號：NVS-0099）；兔二抗（丹麥 Dako公司，批號：K4003）；鼠二抗（丹麥Dako公司，批號：K4001）；DAB顯色劑（丹麥Dako公司，批號：K3468）；SYBR?Premix Ex Taq（日本 Takara公司，批號：RR820A）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（日本Takara公司，批號：RR047A）。

1.4 儀器 組織脫水機(jī)（常州普瑞斯星醫(yī)療器械有限公司，型號：PQT-A）；組織包埋機(jī)（常州普瑞斯星醫(yī)療器械有限公司，型號：PBM-A）；病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2235）；組織攤片機(jī)（常州普瑞斯星醫(yī)療器械有限公司，型號：PHY-Ⅲ）；烤箱（天津泰斯特儀器有限公司，型號：WGL-125B）；顯微鏡（日本尼康公司，型號：H550S）；顯微鏡成像系統(tǒng)（日本尼康公司，型號：DS-RI2）；PCR儀（美國Applied biosystems公司，型號：Veriti）；紫外-可見光分光光度計(jì)（美國Thermo fisher公司，型號：Nano drop 2000）

2 方法

2.1 動物模型制備 本次實(shí)驗(yàn)所用的60只SPF級小鼠均采用Hulth法制備KOA模型，麻醉方式為4%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，首先于小鼠腿部膝關(guān)節(jié)處備皮消毒，由髕旁內(nèi)側(cè)切口顯露髕骨向外側(cè)脫位，手術(shù)刀切斷前交叉韌帶，止血后將髕骨復(fù)位，關(guān)節(jié)腔逐層閉合。術(shù)后為預(yù)防感染，予每只小鼠肌肉注射青霉素鈉（3×104U）連續(xù)3 d。

2.2 動物分組及給藥 造模成功后的60只SPF級小鼠隨機(jī)分為3組，每組各20只，分別為骨痹合劑組、氨糖美辛組、生理鹽水組，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始干預(yù)。骨痹合劑組以骨痹合劑13 mL/（kg·次）灌胃，氨糖美辛組將“氨糖美辛腸溶片”溶解于等體積蒸餾水19.5 mg/（kg·次）灌胃；對照組以同體積生理鹽水灌胃，每日上午、下午各1次，連續(xù)灌胃8周。

2.3 取材 連續(xù)8周灌胃后，小鼠予戊巴比妥鈉腹腔過麻處死。取雙下肢，去除皮膚和肌肉，分離膝關(guān)節(jié)并保留其相連的脛骨和股骨，取雙下膝關(guān)節(jié)軟骨檢測。將左膝關(guān)節(jié)甲醛固定，右膝關(guān)節(jié)于體式顯微鏡下剝離膝關(guān)節(jié)軟骨，-80℃保存。

2.4 組織石蠟包埋切片 將小鼠關(guān)節(jié)軟骨的新鮮組織用4%多聚甲醛固定，24 h后將組織置于脫水盒內(nèi)進(jìn)行脫水，隨后將浸好蠟的小鼠膝關(guān)節(jié)組織進(jìn)行包埋，于-20℃冷臺冷卻，等待蠟?zāi)毯髮⑾炦M(jìn)行修整，將蠟塊切至為4 μm的薄片。

2.5 HE染色 依次將備好的切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ溶液各20 min，無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各10 min，梯度酒精各5 min，隨后使用蒸餾水洗將切片凈。經(jīng)過蘇木素染核，鹽酸乙醇分化，氨水返藍(lán)后流水沖洗。切片入伊紅染液染細(xì)胞質(zhì)，中性樹膠封片。

2.6 免疫組化檢測 切片脫蠟至水后放置于EDTA抗原修復(fù)液中修復(fù)，待修復(fù)后放入3%過氧化氫溶液中予室溫避光孵育10 min，于血清封閉液室溫封閉20 min。一抗4℃過夜，二抗室溫孵育1 h，DAB顯色后顯微鏡控制顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。脫水干燥，運(yùn)用二甲苯透明，使用中性樹膠封固。

2.7 PCR檢測 將軟骨置于液氮研缽中磨成粉狀，加入Trizol提取總mRNA，據(jù)nano drop測定RNA樣品濃度。按照試劑盒說明書合成cDNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)。以GAPDH作為內(nèi)參。反應(yīng)條件為預(yù)變性 95 ℃、2 min，變性 95 ℃、15 s，退火 60 ℃、30 s，延伸60℃、1 min。總共45個循環(huán)。經(jīng)2-△△CT處理數(shù)據(jù)分析相對表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，實(shí)驗(yàn)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 形態(tài)學(xué)改變 可見對照組軟骨表面缺損且軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且軟骨表面粗糙；與生理鹽水組比，骨痹合劑組和氨糖美辛組較軟骨組織有明顯改善，軟骨表面細(xì)微裂隙減少，軟骨細(xì)胞數(shù)目增加；氨糖美辛組與骨痹合劑組未見明顯差異。見圖1。

圖1 各組軟骨組織HE染色形態(tài)學(xué)比較（×200）

3.2 免疫組化 Bad、Caspase-3、Caspase-9、NF-κB蛋白檢測結(jié)果 可見生理鹽水組中軟骨表面4種蛋白均高表達(dá)；與對照組相比，兩用藥組軟骨組織中4種蛋白表達(dá)均降低（P<0.01或P<0.05）。見圖2-5、表 1。

圖2 各組軟骨組織Bad蛋白表達(dá)比較

表1 各組軟骨組織蛋白表達(dá)IOD值（±s，n=3）

表1 各組軟骨組織蛋白表達(dá)IOD值（±s，n=3）

注：與生理鹽水組比較，*P<0.01，**P<0.05.

項(xiàng)目 B a d C a s p a s e-3 C a s p a s e-9 N F-κ B生理鹽水組 5 0 3 7±8 6 9 5 1 9 0±8 7 6 5 4 2 1±9 1 4 5 6 2 6±7 1 8骨痹合劑組 3 0 5 6±7 7 9*3 1 5 1±9 0 6*3 3 7 3±7 4 2*3 3 8 1±6 7 6*氨糖美辛組 3 3 3 2±7 2 3 3 2 7 9±9 4 3 3 2 8 3±7 3 7*3 4 5 7±7 5 1*

圖3 各組軟骨組織Caspase-3蛋白表達(dá)比較

圖4 各組軟骨組織Caspase-9蛋白表達(dá)比較

圖5 各組軟骨組織NF-κB蛋白表達(dá)比較

3.3 PCR 檢測 Bad、Caspase-3、Caspase-9、NF-κB mRNA 與生理鹽水組比較，骨痹合劑組和氨糖美辛組小鼠關(guān)節(jié)軟骨中 Bad、Caspase-3、Caspase-9、NF-κB mRNA表達(dá)均顯著降低（P<0.01或P<0.05）。兩用藥組之間未見明顯差異。見圖6。

圖6 各組軟骨組織Bad、Caspase-3、Caspase-9、NF-κB mRNA表達(dá)比較

4 討論

4.1 KOA與活血通絡(luò)法的關(guān)系 在《內(nèi)經(jīng)》中記載的痹病種類繁多，諸如五臟痹、六腑痹、節(jié)痹等，根據(jù)分析，臨床表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬、活動不利的KOA當(dāng)屬于五體肢節(jié)痹中“骨痹”范疇[15]。《醫(yī)林改錯》中提出“瘀血導(dǎo)致痹病”的理念；《靈樞·本臟》中提出“經(jīng)脈者，所以行血?dú)舛鵂I陰陽，濡筋骨，利關(guān)節(jié)也。血和而經(jīng)脈流行……筋骨勁強(qiáng)，關(guān)節(jié)清利矣”，認(rèn)為瘀血阻滯、氣血不行、關(guān)節(jié)筋骨失于潤養(yǎng)而發(fā)病；《類證制裁·痹癥》云：“由營衛(wèi)先虛，腠理不密，風(fēng)寒濕乘虛內(nèi)襲，正氣為邪所阻，不能宣行，因而留滯，氣血凝澀，久而成痹。”指出正氣虧虛，無力抵御外邪入侵，導(dǎo)致氣血凝滯阻塞脈絡(luò)，久而成痹；《張氏醫(yī)通》又載：“膝痛無有不因肝腎虛者，虛則風(fēng)寒濕襲之”[16]。綜上所述，膝痹病的內(nèi)因多由于肝腎氣血虧虛，筋骨失榮，氣虛血瘀痹阻于局部經(jīng)絡(luò)；外因多是由風(fēng)、寒、濕邪壅塞經(jīng)絡(luò)，氣血凝滯所致[17]。瘀血被認(rèn)為是本病發(fā)生的關(guān)鍵病機(jī)，瘀血為骨關(guān)節(jié)炎的病理因素。我院骨傷科王琦教授在多年來運(yùn)用中醫(yī)藥治療膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床經(jīng)驗(yàn)以及對于文獻(xiàn)、古籍查閱學(xué)習(xí)的基礎(chǔ)上，認(rèn)為“調(diào)節(jié)氣機(jī)”與“通達(dá)經(jīng)絡(luò)”為治療痹證的關(guān)鍵。“氣為血之帥，血為氣之母”，氣血關(guān)系密切，活血以行氣，故活血為調(diào)節(jié)氣機(jī)的關(guān)鍵。《靈樞·經(jīng)脈》云：“經(jīng)脈者，所以決死生，處百病，調(diào)虛實(shí)，不可不通[18]。”而瘀血痹阻經(jīng)絡(luò)，不通則通，因此痹證會表現(xiàn)為疼痛、屈伸不利等癥狀。經(jīng)絡(luò)調(diào)達(dá)內(nèi)外上下，是運(yùn)行氣血的通道，基于此，王琦教授認(rèn)為通達(dá)經(jīng)絡(luò)是治療骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵。只有將經(jīng)絡(luò)調(diào)節(jié)平衡，氣血才得以運(yùn)行，通則不痛。調(diào)節(jié)氣機(jī)與通達(dá)經(jīng)絡(luò)相輔相成，共同起到活血通絡(luò)之功。以此思路為基礎(chǔ)，研發(fā)了骨痹合劑。骨痹合劑由當(dāng)歸、丹參、紅花、桂枝、桑寄生、地龍、杜仲、枸杞、蒼術(shù)、細(xì)辛等10多味藥物組成，全方以活血通絡(luò)為主，又兼祛風(fēng)除濕、補(bǔ)益肝腎之功。經(jīng)臨床應(yīng)用表明骨痹合劑療效確切[19]。但其具體作用機(jī)制目前尚未明確，故需要進(jìn)一步深入研究，在本次研究中，以KOA模型小鼠為實(shí)驗(yàn)研究對象，以具有活血通絡(luò)作用的骨痹合劑對KOA模型小鼠灌胃，通過以方測法，來探究基于PI3K/Akt信號傳導(dǎo)途徑活血通絡(luò)法防治KOA的分子機(jī)制。

4.2 KOA與PI3K/Akt信號通路的關(guān)系 KOA是一種漸進(jìn)性關(guān)節(jié)軟骨退變疾病，其病理特征為關(guān)節(jié)軟骨退變，以膝關(guān)節(jié)變性、骨糜爛、滑膜炎為主要病理進(jìn)程。好發(fā)于中老年人，是骨傷科的常見病、難治疾病之一。關(guān)節(jié)軟骨退行性改變是KOA的主要病理特征，軟骨細(xì)胞凋亡是KOA發(fā)病的重要原因[20-22]。細(xì)胞凋亡增加，會導(dǎo)致軟骨基質(zhì)降解，基質(zhì)合成減少[23]，通過有效抑制軟骨細(xì)胞凋亡從而防治KOA的產(chǎn)生和發(fā)展。PI3K/Akt信號通路有“抗凋亡途徑”之稱，被認(rèn)為是軟骨細(xì)胞存活的首要通路，能將信號由細(xì)胞膜快速傳到到細(xì)胞核，參與多種細(xì)胞增殖、分化調(diào)節(jié)和凋亡的過程，并且可以有效地調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖、凋亡以及基質(zhì)重塑，其下游Bad、Caspase和NF-κB為重要的促膝骨關(guān)節(jié)軟骨凋亡因子[24]。Bad是Bcl-2家族成員之一，未磷酸化Bad與Bcl-2家族成員形成同源二聚體，提高線粒體通透性，細(xì)胞色素C釋放，Caspases連鎖反應(yīng)激活，故而細(xì)胞發(fā)生凋亡[25]。Caspase家族在細(xì)胞凋亡過程中扮演重要角色，有兩類分子發(fā)生作用：其一是起始Caspases因子（例如Caspase-2，8和9），在接收胞質(zhì)上游凋亡信號刺激后激活下游Caspase分子活化。Caspase-9可聯(lián)系凋亡內(nèi)外源，并級聯(lián)激活Caspase家族因子擴(kuò)大凋亡信號；其二是效應(yīng)Caspases因子（例如Caspase-3，6等），當(dāng)效應(yīng)因子被激活并逐級活化后，特異性水解一系列蛋白質(zhì)底物，從而誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡。Caspase-3被稱為“死亡蛋白酶”，因?yàn)榧せ畹腃aspase-3引起下游的凋亡反應(yīng)，從而促使細(xì)胞發(fā)生凋亡，Caspase-3的活化預(yù)示細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段[26]。由此推斷，可以通過介入PI3K/Akt途徑降低Caspase-3、Caspase-9的活性，達(dá)到減輕KOA損傷所致的細(xì)胞凋亡的目的。NF-κB參加多種生物學(xué)過程，是廣泛存在于真核細(xì)胞的多向性轉(zhuǎn)錄因子，有著調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子、生化因子及酶等基因表達(dá)的作用[27]。激活的NF-kB調(diào)節(jié)了一系列誘導(dǎo)ECM破壞的細(xì)胞因子的表達(dá)，加劇了KOA的過程[28]。故有效抑制NF-kB通路也許是治療KOA的潛在方向。綜上所述，PI3K磷酸化活化后激活下游Akt，活化的Akt能有效降低Bad蛋白、Caspase-3蛋白等凋亡前蛋白從而起到抑制細(xì)胞凋亡的作用[29]。

Hulth法是誘導(dǎo)KOA模型的的經(jīng)典方法。此方采用切除內(nèi)側(cè)半月板及前交叉韌帶，手術(shù)創(chuàng)傷小，成功率高，可成功建立KOA模型。在本次實(shí)驗(yàn)中，生理鹽水組出現(xiàn)軟骨表面可見缺損且軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，軟骨表面粗糙，表明KOA模型制備成功；骨痹合劑組小鼠的軟骨組織較生理鹽水組有明顯改善，軟骨表面細(xì)微裂隙減少，軟骨細(xì)胞數(shù)目增加。表明骨痹合劑具有修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的作用。免疫組化蛋白檢測中可見骨痹合劑組軟骨組織中Bad蛋白、Caspase-3蛋白、Caspase-9蛋白、NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)；PCR檢測中可見骨痹合劑組 Bad、Caspase-3、Caspase-9、NF-κB mRNA表達(dá)下調(diào)，與生理鹽水組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此推斷骨痹合劑能調(diào)控KOA小鼠軟骨細(xì)胞PI3K/Akt信號通路，降低 Bad、Caspase-3、Caspase-9以及NF-κB蛋白和基因表達(dá)。從而抑制促凋亡蛋白，促進(jìn)細(xì)胞存活以達(dá)到防治KOA的效果。綜上所述，基于活血通絡(luò)法的骨痹合劑通過調(diào)控PI3K/Akt通路下調(diào)促凋亡蛋白Bad、Caspase-3、Caspase-9以及NF-κB蛋白和基因表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞存活，減輕KOA損傷而導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，延緩KOA病程進(jìn)展。