基于CYP1B1酶抑制活性的澤瀉95%乙醇提取物化學成分的UPLC-IT-TOF/MS分析*

張 敏，陳興龍，李 蘭，龍俊君，羅永謀，唐麗萍，李 勇△

（1.昆明醫科大學附屬甘美醫院/昆明市第一人民醫院，云南 昆明 650224；2.云南中醫藥大學中藥學院暨云南省南藥可持續利用重點實驗室,云南 昆明 650500；3.昆明醫科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室,云南 昆明 650500）

細胞色素 P450 1B1（Cytochrome P450 1B1，CYP1B1）酶是一種催化底物環氧化及羥基化的亞鐵血紅素-硫醇鹽單加氧酶，研究表明，CYP1B1基因突變及進而抑制CYP1B1酶參與的相關底物如視黃酸、褪黑素、花生四烯酸等的代謝與青光眼的發病存在關聯[1-2]。

傳統中藥在治療青光眼方面有悠久的應用歷史，眼科專著《眼科龍木論》，提出了五風內障之說，對青光眼的病因病機、臨床證候、治療方藥、針灸等作出詳細論述[3]。來自藥用植物的天然產物化學結構多樣，經過了長期的生物選擇，具有較好的生物契合度和類藥性，是藥物活性先導化合物發現的重要源泉，但也是CYP1B1酶抑制劑的重要來源，故傳統中藥部分主要有效成分可能具有抑制CYP1B1酶活性的作用，即可能在治療青光眼時產生一定的拮抗作用。中藥澤瀉為澤瀉科植物東方澤瀉（Alisma orientale（Sam.）Juzep.）或澤瀉（Alisma plantago-aquatica Linn.）的干燥塊莖，其性寒，味甘，歸腎經、膀胱經。澤瀉具利水滲濕、泄熱、化濁降脂功效，屬利水滲濕藥下分類的利尿通淋藥[4-5]，作為治療青光眼中藥處方藥中常用配伍藥物之一。因此，本研究對具有顯著抑制CYP1B1酶活性的澤瀉95%乙醇提取物進行化學成分分析。

1 材料和方法

1.1 澤瀉95%乙醇提取物抑制CYP1B1酶活性實驗

1.1.1 儀器 UPLC-ESI-QTOFMS分析所用儀器為Agiletn公司生產的Agilent UPLC/Q-Tof液質聯用儀，儀器型號為Agilent 1290 UPLC/6540 Q-TOF。

1.1.2 試藥和試劑 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），小鼠肝微粒體（MLM），β-雌二醇，白藜蘆醇，乙腈。

1.1.3 實驗反應體系 反應體系包含β-雌二醇（20 μM），白藜蘆醇（10 μM）或澤瀉 95%乙醇提取物（50 μg/mL），MLM（0.5 mg/mL），緩沖液（PBS，pH=7.4）。反應體系孵育后，加入NADPH進行反應，終止反應后離心，取上清液待測。孵育體系一式3份。①陽性對照組：同時有白藜蘆醇和β-雌二醇。②陰性對照組：沒有NADPH，用等體積PBS代替。③實驗組：同時有β-雌二醇和中藥提取物。④空白組：只有β-雌二醇。

1.1.4 液相色譜條件 色譜柱為XDB-C18柱（2.1 mm × 100 mm，1.8mm，Agilent，Santa Clara，CA），紫外檢測波長范圍為190～400 nm，柱溫45℃。流動相A：甲酸/水（0.01/100，v/v），B：甲酸/乙腈（0.01/100，v/v）；流速為0.30 mL/min；梯度洗脫條件：0～12 min，2%～98%B；12～14 min，98%B；14～16 min，98%A。進樣量為：5 μL。

1.1.5 質譜條件 質譜分析條件為正離子全掃描模式，掃描范圍：50-800 m/z，目標離子為 273.184 9（β-雌二醇）和289.179 8（4-羥基-β-雌二醇）。碰撞氣體和干燥氣體流速9 L/min。毛細管電壓3.5 kV，溫度為350℃，霧化壓力 35 psi。

1.1.6 多變量數據分析和統計分析 使用Mass Hunter Workststion數據軟件采集軟件（Agilent，Santa Clara，CA，USA）進行色譜和光譜數據分析。所有值均以均值表示，應用Prism v.6進行統計分析。按下列計算目標化合物的酶活性抑制率。

陽性組或藥物組的相對含量=陽性組或藥物組的代謝產物的峰面積均值（AS）/空白組的代謝產物的峰面積均值（AC）×100%

CYP1B1酶抑制率（%）=100%-陽性組或藥物組的相對含量

P<0.01，具有統計學意義。

1.2 澤瀉95%乙醇提取物化學成分的UPLC-ITTOF/MS分析

1.2.1 儀器 LC-MS分析所用儀器為島津公司（Shimaduz，Kyoto，Japan） 生產的 LCMS-IT-TOF 儀。液相色譜儀控制器型號為CBM-20A，泵型號為LC-30AD，自動進樣器型號為SIL-30AC，柱溫箱型號為CTO-20AC，脫氣裝置型號為DGU-20A5，二極管陣列檢測器為SPD-M20A。

1.2.2 試藥和試劑 澤瀉購自昆明市螺螄灣中藥材市場（產自四川），經昆明醫科大學唐麗萍教授鑒定為植物澤瀉（Alisma plantago-aquatica Linn.）的干燥塊莖；色譜純乙腈購自德國默克公司，超純水由默克MingCheTM-D24UV設備制備，色譜純甲酸購自上海阿拉丁試劑公司。

1.2.3 供試品溶液制備 干燥藥材澤瀉10 g，粉碎，用95%乙醇250 mL浸泡1h，加熱至微沸，加熱1h，過濾濃縮得浸膏1.8 g。取5 mg浸膏，加入2 mL甲醇超聲溶解，于10 000 r/min離心10 min，取上清液進樣。

1.2.4 液相色譜條件 色譜柱為UHPLC XB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），紫外檢測波長范圍為190～400 nm，柱溫30℃。流動相A：甲酸/水（0.05/100，v/v），B：乙腈；流速為 0.20 mL/min；梯度洗脫條件：起始梯度為 5%B，0～50 min，5%～90%B；50～55 min，90%B；55～56 min，5%～90%B；56～60 min，5%B。進樣量為：2 μL。

1.2.5 質譜條件 質譜條件：離子源為ESI源，三氟乙酸鈉校正，電噴霧正負離子同時檢測。分析條件如下：噴霧電壓為4.50 kV或-3.50 kV；檢測電壓為1.65 kV；旋轉式真空泵壓力為71.0 Pa；干燥氣壓力為110.0 kPa；噴霧氣為氮氣，流速為1.5 L/min；曲形裂解器（CDL）溫度為200℃；加熱模塊溫度為200℃；離子捕獲時間為10 ms；母離子選擇范圍為m/z±3.0 Da；裂解能量（CID）為50%；裂解氣為氬氣，掃描范圍為 m/z 100～1 000。Shimadzu Composition Formula Predictor軟件用于預測分子式。

2 結果

澤瀉的95%乙醇提取物對CYP1B1酶顯示顯著抑制活性，其代謝產物4-羥基-β-雌二醇的峰面積分別為0，0，1 164.5，抑制率為93.96%；陽性對照組白藜蘆醇的代謝產物4-羥基-β-雌二醇的峰面積分別為 3 946.00，3 469.38，2 851.21；抑制率為 46.72%，空白組的代謝產物4-羥基-β-雌二醇的峰面積分別為6 435.47，6 660.91，6 173.66，均值6 423.35。澤瀉的95%乙醇提取物在實驗色譜、質譜條件下響應良好，經過分析發現其主要化合物為原萜烷型三萜，保留時間集中在10～50 min之間，最大離子流圖（BPC）如圖1所示。共分析鑒定了25個原萜烷型三萜類成分，化學結構如圖2所示。

圖1 澤瀉在LC-MS分析條件下的最大離子流圖

圖2 原萜烷型三萜的結構

LCMS-IT-TOF儀可以測出化合物的精確分子量，Shimadzu Composition Formula Predictor軟件結合氮規則的運用可以預測出化合物的準確分子式；通過自動模式選擇豐度較高的離子碎片進行碰撞可以給出其二級特征碎片。由高分辨分子量、分子式、多級質譜特征碎片結合Scifinder數據庫可以初步推斷化合物的基本結構信息，進而快速識別澤瀉中的原萜烷型三萜類成分。色譜峰的鑒定結果如表1所示，主要展示色譜峰保留時間、分子量、分子式、二級質譜碎片以及化合物名稱等。根據化合物的結構不同，將識別到的色譜峰分為5類，通過不同類型化合物的結構特征來說明其鑒別過程。

表1 澤瀉中色譜峰的LC/ESI-MSn鑒定結果

A 型原萜烷型三萜（1～3，5～7，9，14，17，20，22）主要結構特征為C-16位含有羰基，因此與C-13和C-17位之間的雙鍵形成了α，β不飽和酮結構，有一定的紫外吸收，側鏈的C-23，C-24和C-25位一般有羥基或者乙酰氧基取代，部分化合物在C-24和C-25位之間形成了三元氧化，不含環氧環的為A1型，含有環氧環的為A2型。對于A1型化合物而言，較容易失去側鏈的取代基，尤其是含有乙酰氧基的時候最容易失去，形成基峰離子，然后失去C-23位的側鏈形成含26個碳原子的碎片離子。以色譜峰1為例，在正離子模式下最容易檢測到其[M+H]+和[M+Na]+離子，分別為m/z 505.351 5和527.339 9，預測其分子式為C30H48O6，以m/z 505.351 5為母離子進行轟擊，檢測到依次失去3個羥基，即脫去3分子H2O 的碎片，分別為 m/z 487.341 7（C30H46O5，-0.1），469.337 1（C30H44O4，+5.9）和 451.317 4（C30H42O3，-3.3），對應于原萜烷型三萜側鏈上3個羥基的丟失，同時還生成基峰離子m/z415.2853（C26H38O4，+1.0），對應 C-23位側鏈的整體丟失；通過查閱文獻[6-8]比對，澤瀉中化合物16-氧代-澤瀉醇A（16-oxoalisol A）滿足該裂解條件，因此將色譜峰1鑒定為16-氧代-澤瀉醇A（16-oxoalisol A）。對于A2型化合物而言，因為側鏈三元環氧環的存在，不容易檢測到連續失去羥基的碎片，如色譜峰20，高分辨質譜測得其[M+H]+和[M+Na]+離子分別為m/z 545.348 0和567.329 5，預測其分子式為C32H48O7，檢測到失去乙酰氧基的基峰離子碎片m/z 467.326 0（C30H42O4，+10.4），推測該化合物含有乙酰氧基，同時碎片離子 m/z 387.248 2（C24H34O4，-4.8）的豐度也較高，推測為C-20位側鏈丟失產生，經查閱文獻[9]，化合物23-乙酰澤瀉醇M（Alisol M 23-acetate）的裂解行為與之相符，因此色譜峰20鑒定為23-乙酰澤瀉醇M（Alisol M 23-acetate）。圖3展示了色譜峰1和20的裂解途徑。

圖3 正離子模式下16-oxoalisol A，alisol M 23-acetate和alisol A的裂解途徑

B 型原萜烷型三萜（11～13，15，18，21，23，25）C-16不含氧原子取代，因此與C-13和C-17位之間的雙鍵無法形成α，β不飽和酮結構，紫外吸收較弱，與A型相似，該類型化合物側鏈的C-23，C-24和C-25位一般有羥基或者乙酰氧基取代，部分化合物在C-24和C-25位之間形成了三元氧化，不含環氧環的為B1型，含有環氧環的為B2型。這類型化合物在澤瀉乙醇提取物中含量較高，因此色譜峰響應較好，檢測較多的離子碎片。色譜峰12檢測到其[M+Na]+峰為m/z 513.350 0[M+HCOO]-峰為m/z 535.356 8（-7.2），因此預測其分子式為 C30H50O5，m/z 473.363 3（C30H48O4，-4.9），455.349 2（C30H46O3，-2.8）和 437.336 9（C30H44O2，-4.5）是連續失去3個羥基產生的碎片，m/z 365.281 3（C26H36O，-2.6）為失去 C-23 側鏈生成的碎片，這些裂解行為與澤瀉醇 A（Alisol A）[7，10]相符，因此色譜峰12被鑒定為澤瀉醇A（Alisol A）。圖3展示了色譜峰12的裂解途徑。

C型原萜烷型三萜（8，24）的主要結構特征為C-16位被過氧基或者乙氧基取代，因此該類型化合物的主要質譜裂解特征行為就是C-16位取代基的丟失，色譜峰8和24分別檢測到失去過氧基和乙氧基的碎片離子 m/z 455.281 5（C30H40O2，-10.6）和475.346 2 （C30H44O3，+7.8），因此其結構得以鑒定。

D型原萜烷型三萜（16，19）在C-16位和C-23位之間形成了六元氧環，因此側鏈的裂解基本都是在C-23位，形成含有26個碳原子的碎片離子m/z 439.266 3(C26H40O4，-15.6）和 421.276 1（C26H38O3，+4.8），通過這些特征碎片可以鑒定色譜峰16和19的結構。

E型原萜烷型三萜（4，10），其C-13位和C-17位之間未能形成雙鍵，被環氧環或者羥基取代，這類型化合物除了側鏈基團的裂解外，C-13位和C-17位之間的環氧環或羥基也能裂解，形成特征的質譜碎片，結合數據庫搜索[11-12]，可將其結構初步鑒定。

3 結論

中藥澤瀉是最常用的中藥之一，近代藥理研究證明，澤瀉具有抗炎、利尿、降血壓、降血脂、抗乙型肝炎病毒、抗脂肪肝等作用；原萜烷型三萜和倍半萜類是澤瀉的主要化學成分[13-18]。本文通過CYP1B1酶活性實驗發現，澤瀉的95%乙醇提取物對CYP1B1酶抑制率為93.96%，顯示顯著抑酶活性。通過LC-MS分析，發現其主要化合物為原萜烷型三萜，且在ESI源下以正離子模式響應較好，其二級質譜碎片也較為豐富，較易檢測到[M+H]+和[M+Na]+離子，負離子模式下[M+HCOO]-離子的豐度最高。通過以[M+H]+或[M+Na]+離子作為母離子進行轟擊，其主要裂解途徑為失去側鏈的羥基或者乙酰氧基，同時C-20或者C-23位側鏈也容易失去，形成含有24或者26個碳原子的離子碎片，為色譜峰的質譜鑒定提供了豐富的信息；通過將化合物的結構進行分類，總結其質譜裂解規律，為進一步通過LC-MS靶向研究澤瀉的生物活性成分提供了依據。