昆明地區(qū)脂肪肝痰瘀證候ZJU指數(shù)及基因多態(tài)性研究*

楊 艷 ，洪 力 ，韋姍姍 ，2，姚 政 ，3，季能博 ，徐 尋 ，呂一航 ，王維 ，2，3△

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.云南省中醫(yī)藥學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；3.云南省高校中醫(yī)證候微觀辨證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500）

脂肪肝（fatty liver disease，F(xiàn)LD）是臨床常見(jiàn)的以代謝障礙為病理表現(xiàn)的肝臟疾病[1]。根據(jù)飲酒是否過(guò)量，F(xiàn)LD可分為酒精性脂肪性肝病（alcohol fatty liver disease，AFLD）和非酒精性脂肪性肝病（non-alcohol fatty liver disease，NAFLD）。FLD 是一種慢性疾病，在臨床工作中，由于患者生活習(xí)慣等原因，不易精確鑒別NAFLD與AFLD，但在患病率程度上NAFLD可反映FLD的流行狀況[2]。

中醫(yī)一般將脂肪肝被歸入“積聚”“肥氣”“癥瘕”等病的范疇中[3]。其病因常常被認(rèn)為與過(guò)食膏粱厚味、飲酒等生活習(xí)慣及遺傳有關(guān)。飲食不節(jié)導(dǎo)致脾失健運(yùn)，痰濕內(nèi)生，痰濕困脾，則肝亦受伐，肝失疏泄，導(dǎo)致氣機(jī)不暢，最終痰濕為患。痰濕日久積滯，氣行不利、血行不暢而成瘀。故痰瘀相關(guān)證候?yàn)橹靖纬Ｒ?jiàn)證候。從現(xiàn)代基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)角度上看，脂肪肝患者痰瘀證候的形成與機(jī)體胰島素抵抗引起的糖脂代謝紊亂及其病理產(chǎn)物關(guān)系緊密[4]。大量流行病學(xué)研究均顯示脂肪肝患者在諸如血糖、血脂、血液流變學(xué)等血生化指標(biāo)上存在明顯異常[5-7]。

ZJU指數(shù)[8]是浙江大學(xué)根據(jù)生化指標(biāo)結(jié)合中國(guó)人體質(zhì)提出適用于中國(guó)人的非酒精脂肪肝確診的一個(gè)指數(shù)。相比于脂肪肝指數(shù)（Fatty liver index，F(xiàn)LI）[9]，更適合于中國(guó)人的具體情況[8]。ZJU指數(shù)=BMI（kg/m2）+FPG（mmol/L）+TG（mmol/L）+3 × ALT/AST（如果是女性則+2）[10]。該指數(shù)小于32不容易出現(xiàn)脂肪肝，大于38容易出現(xiàn)脂肪肝。影響ZJU指數(shù)的參數(shù)包括了與糖、脂代謝及肝功能相關(guān)的指標(biāo)，這些指標(biāo)的差異除了與患者個(gè)人生活習(xí)慣相關(guān)外，也受到糖脂代謝基因的遺傳背景的影響。因此，這一參數(shù)的設(shè)計(jì)理念與中醫(yī)對(duì)該疾病的認(rèn)識(shí)具有較高相似度。

脂質(zhì)代謝基因多態(tài)性作為直接影響機(jī)體脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)和FLD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，近年來(lái)一直是探討FLD發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)。如馬鈴薯糖蛋白樣磷酸酶（Patatin Like Phospholipase Domain Containing 3，PNPLA3）第二外顯子 rs738409（I148M）的突變會(huì)通過(guò)減緩細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的水解速度，促進(jìn)甘油三酯在肝內(nèi)的沉積[11-14]，且基因型的頻率與非酒精性脂肪肝發(fā)病率的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果相吻合[15]。脂聯(lián)素（Adiponectin，APN）基因第一外顯子rs2241766（T45G）、內(nèi)含子 rs1501299（G276T）的突變可能通過(guò)降低血清脂聯(lián)素水平而導(dǎo)致胰島素抵抗加劇，破壞體內(nèi)脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)。瘦素（Leptin，LEP）基因啟動(dòng)子上游rs7799039（G-2584A）位點(diǎn)，瘦素受體（Leptin receptor，LEPR） 基因第一外顯子 rs1137100（K109R）位點(diǎn)突變則會(huì)通過(guò)影響瘦素表達(dá)水平及瘦素與受體相互作用加劇胰島素抵抗和糖脂代謝紊亂。所以，基于這些基因突變導(dǎo)致的糖脂代謝紊亂的病理產(chǎn)物，從基因多態(tài)性角度探討遺傳背景與脂肪肝痰瘀證候之間的關(guān)系是可行且必要的。

昆明地處云貴高原，是多民族聚集的省會(huì)城市，城鎮(zhèn)人口脂肪肝發(fā)病率相對(duì)較高，且痰瘀相關(guān)證候人群比例高，因此，本研究通過(guò)分析中國(guó)云南昆明地區(qū)人群中痰瘀證型（痰瘀互結(jié)、痰濕內(nèi)阻）FLD患者與對(duì)照者之間血液生化指標(biāo)、ZJU指數(shù)、相關(guān)基因多態(tài)性與脂肪肝之間的關(guān)系，進(jìn)一步探討多態(tài)性差異與生化指標(biāo)對(duì)脂肪肝患者中醫(yī)辨證分型的參考意義，為痰瘀證型FLD的早期預(yù)測(cè)、診斷及治療提供依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 痰瘀證型FLD病例組40例，均來(lái)自2018年10月至2019年2月云南省中醫(yī)院、昆明市中醫(yī)院、云南中醫(yī)藥大學(xué)院第一附屬醫(yī)院滇池體檢中心就診患者，診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組2010年修訂的脂肪肝診斷影像學(xué)標(biāo)準(zhǔn)診斷，中醫(yī)辨證分型屬于痰濕內(nèi)阻證型或痰瘀互結(jié)證型，同時(shí)排除信息填寫(xiě)不完整者或缺失者和生命體征不穩(wěn)定或臨床診斷為先天性代謝異常綜合癥、免疫系統(tǒng)疾病、病毒性肝炎、肝膽胃腸疾病、癌癥及手術(shù)和嚴(yán)重藥物依賴(lài)者；無(wú)FLD對(duì)照組40例，均來(lái)自同期在體檢中心體檢的健康人群。所有研究對(duì)象彼此間無(wú)親緣關(guān)系。所有入組者知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 臨床及血液生化指標(biāo)檢測(cè)

1.2.1 臨床指標(biāo)檢測(cè) 記錄患者年齡、性別，測(cè)量身高、體質(zhì)量，計(jì)算體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI）。

1.2.2 血液生化指標(biāo)檢測(cè) 血液采集：患者于采血前一晚20：00開(kāi)始空腹12 h以上，次日空腹采集靜脈血，使用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDLC）、空腹血糖（FPG）的含量。另采集5 mL靜脈血于抗凝管保存于-80℃冰箱內(nèi)，用于基因組DNA提取。

1.3 基因組DNA提取及測(cè)序分型

1.3.1 提取全基因組DNA 采用AXYGEN全血基因DNA試劑盒快速提取基因組DNA，提取得到的基因組DNA置于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 基因多態(tài)性檢測(cè) 對(duì)保存?zhèn)溆玫腄NA樣本進(jìn)行純度和完整性檢測(cè)，對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50 μL） 如下：10 × PCR Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，引物（F+R）各 2 μL（引物序列見(jiàn)表 1），Taq 酶 1μ L，基因組 DNA 2 μL，ddH2O 補(bǔ)足 50 μL。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性 94℃ 10 min→變性 94℃ 30 s→退火（APN T45G、APN G276T、LEP G-2548A、PNPLA3 I148M 為57.5℃，LEPR K109R 為 55℃）→延伸 72℃ 1 min→最后72℃延伸10 min，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物由昆明擎科生物有限公司進(jìn)行基因位點(diǎn)的測(cè)序，對(duì)返回的結(jié)果進(jìn)行分析。

表1 基因引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料使用頻數(shù)（n）和百分比（%）描述；計(jì)數(shù)資料的統(tǒng)計(jì)分析使用χ2檢驗(yàn)；二分類(lèi)資料的多因素分析使用二元Logistic回歸分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZJU指數(shù)對(duì)比 本地區(qū)的之前有橫斷面調(diào)查顯示，ZJU指數(shù)具有良好的甄別脂肪肝人群的功能，對(duì)中醫(yī)證候的分型也是有一定的區(qū)分功能，是一個(gè)具有指導(dǎo)意義的指標(biāo)。本次調(diào)查的ZJU指數(shù)顯示，正常組與痰瘀證型FLD病例組存在顯著差異（P<0.05），如表2所示。與前期研究對(duì)比發(fā)現(xiàn)，本次調(diào)查中的痰瘀證型FLD組ZJU指數(shù)與前期研究中痰瘀互結(jié)、痰濕內(nèi)阻證候的ZJU指數(shù)接近[16]，本次選取的樣本具有代表性。

表2 ZJU指數(shù)水平對(duì)比（±s）

表2 ZJU指數(shù)水平對(duì)比（±s）

注：與正常組比較，*P<0.05。

分組 例數(shù) ZJU指數(shù)正常組 40 33.26±2.83痰瘀證型FLD病例組 40 37.82±4.97*

2.2 生化指標(biāo)對(duì)比 將ZJU指數(shù)中所涉及的生化指標(biāo)逐一統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，脂肪肝組和正常組在BMI和FPG兩個(gè)指標(biāo)上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時(shí)，將ZJU指數(shù)計(jì)算中未包含但可能是FLD危險(xiǎn)因素的生化指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示LDL和HDL在兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），如表3所示。ZJU指數(shù)可作為鑒別中醫(yī)證型的一種輔助指標(biāo)，但區(qū)分具體證型時(shí)需加入其它指標(biāo)，如LDL和HDL。

表 3 ZJU 生化指標(biāo)對(duì)比情況（±s，n=40）

表 3 ZJU 生化指標(biāo)對(duì)比情況（±s，n=40）

注：與正常組比較，*P<0.05。

Z J U含有的Z J U未含的T G/（m m o l·L-1）2 3.8 6±2.0 4 4.9 3±0.4 0 1.7 7±1.1 4 1.1 7±0.2 6 3.0 0±0.7 1痰瘀證型F L D病例組組別B M I/（k g·m-2）F P G/（m m o l·L-1）A L T/A S T L D L/（m m o l·L-1）H D L/（m m o l·L-1）正常組1.0 4±0.3 6 2 5.6 2±3.1 7* 7.3 9±3.1 6* 2.0 7±0.8 9 1.0 2±0.3 6 T C/（m m o l·L-1）4.8 7±0.7 9 5.0 9±1.0 8 1.3 2±0.2 3* 2.6 4±0.7 2*

2.3 FLD相關(guān)基因多態(tài)性分析 生化指標(biāo)的差異提示，在糖、脂代謝方面，脂肪肝組和正常組均存在差異，糖脂又和現(xiàn)代中醫(yī)研究中的“痰”有著一定的相似性[17]。在與脂肪肝形成關(guān)系密切的基因中，PNPLA3是最強(qiáng)的遺傳危險(xiǎn)因子[18-19]，LEP與BMI指數(shù)相關(guān)[20-21]，APN、APN與FPG相關(guān)[22]，LEPR與胰島素抵抗密切相關(guān)[23]，胰島素抵抗又與NAFLD痰瘀證型有關(guān)[24]。對(duì)這些基因的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，LEPR K109R和PNPLA3 I148M存在基因多態(tài)性差異（P<0.05），如表 4 所示。

表4 脂肪肝相關(guān)基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型和等位基因的分布

研究結(jié)果顯示基因的突變與否可能和生化指標(biāo)的改變存在一定的聯(lián)系，但生化指標(biāo)的改變更有可能是多個(gè)方面共同作用的結(jié)果，單個(gè)基因只能影響一部分的結(jié)果。由于本次FLD樣本的來(lái)源均為“痰瘀”相關(guān)證型病例，故推斷LEPR K109R和PNPLA3 I148M兩個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)的差異可能在FLD痰瘀相關(guān)證候形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，這兩個(gè)基因可能是中醫(yī)痰瘀證候的生物學(xué)基礎(chǔ)之一，但單個(gè)基因的差異可能并不是FLD的發(fā)生及證候轉(zhuǎn)歸的決定性因素。

3 討論

FLD在中醫(yī)學(xué)主要被歸入“積聚”“肥氣”“癥瘕”范疇。誠(chéng)如《靈樞·邪氣藏府病形》云：“肝脈……微急為肥氣，在脅下，若復(fù)杯。”FLD的發(fā)生與遺傳、生活習(xí)慣密切相關(guān)，如膏粱厚味、飲酒等都是其病因。病位與肝、脾相關(guān)，初期病機(jī)多為肝郁脾虛，如《傷寒論淺注補(bǔ)正》所載：“濕者，脾之本氣也，土之有濕，則為膏壤，脾秉濕氣，是生膏油”。因此在生理狀態(tài)下脾主運(yùn)化，水谷精微通過(guò)脾的輸布，滋潤(rùn)五臟六腑、四肢百骸，維持著人體的正常生命活動(dòng)；若飲食不節(jié)導(dǎo)致脾失健運(yùn)，則痰濕內(nèi)生，痰濕又困脾，形成惡性循環(huán)。《血證論·臟腑病機(jī)論》云：“食氣入胃，全賴(lài)肝木之氣以疏泄之。”因此脾被痰濕所困，則肝亦受伐，肝失疏泄，導(dǎo)致氣機(jī)不暢，最終痰濕為患。痰濕日久則郁而化熱，形成痰熱互結(jié)之證。痰濕積滯，氣行不利、血行不暢而成瘀，或痰熱日久深入血分，血熱相搏，煎灼血中津液，以致血行不暢，終變?yōu)樘叼龌ソY(jié)之證。《金匱要略》云：“血不利則為水，水聚則成痰”，指出濕痰瘀互為致病因素[24-25]。因此FLD初期以肝脾失職為主要病因，進(jìn)而痰濕內(nèi)生，最終形成以肝郁脾虛為本，痰瘀互結(jié)為標(biāo)的本虛標(biāo)實(shí)之證。

目前關(guān)于脂肪肝形成的原因較為一致的是“多次打擊”學(xué)說(shuō)[26]。其中葡萄糖和血脂代謝紊亂是脂肪肝形成的重要因素之一。ZJU指數(shù)是多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算后得出復(fù)合指標(biāo)，能較為全面地體現(xiàn)人體整體代謝情況，且通過(guò)大數(shù)據(jù)驗(yàn)證，并在本地區(qū)不同人群中可以較為精準(zhǔn)地診斷脂肪肝，但在區(qū)分不同證候間的指導(dǎo)性略顯不足。課題組前期調(diào)查顯示，NAFLD痰濕內(nèi)阻型和痰瘀互結(jié)型分別占調(diào)查總數(shù)的25.3%和14.6%，總體比例接近40%，推測(cè)可能跟本地區(qū)人群飲食結(jié)構(gòu)、遺傳及情志有關(guān)。

將本次調(diào)查的ZJU指數(shù)與痰濕內(nèi)阻型和痰瘀互結(jié)型脂肪肝做二元Logistic回歸分析，以ZJU指數(shù)低于32作為參考量，80名被調(diào)查者中，對(duì)照組ZJU小于32的有11人，痰瘀證型FLD病例組ZJU小于32的有2人。對(duì)照組與痰瘀證型FLD病例組中ZJU指數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.776，P＜0.05）。Logistic 回歸模型顯示，ZJU 指數(shù)在 32～38的人（OR=4.87，95%CI：0.98～24.29）和ZJU指數(shù)大于38的人發(fā)生脂肪肝的風(fēng)險(xiǎn)增加（OR=27.50，95%CI：3.91～193.49）。考慮將優(yōu)化后的基因多態(tài)性等遺傳性因素納入后進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，來(lái)進(jìn)一步優(yōu)化ZJU指數(shù)的指導(dǎo)作用。

對(duì)本次調(diào)查存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的因素做二元Logistic回歸分析，具體為 ZJU 指數(shù)、BMI、FPG、LDL、HDL、LEPR K109R多態(tài)性位點(diǎn)、PNPLA3 I148M多態(tài)性位點(diǎn)，進(jìn)行脂肪肝的多因素二元Logistic回歸分析，分別以ZJU指數(shù)低于32、BMI小于25、FPG小于6.1、LDL 小于 3.12、HDL 大于 1.04、LEPR K109R 基因型AA、PNPLA3 I148M基因型CC為參考量，由于樣本量大小及共線性問(wèn)題建立的模型不穩(wěn)定，只有FPG納入了進(jìn)入回歸方程，80名調(diào)查者中，對(duì)照組FPG正常者39例（97.5%），痰瘀證型FLD病例組FPG正常者18例（55%）。對(duì)照組與痰瘀證型FLD病例組中 FPG異常率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=31.580，P＜0.05）。Logistic回歸模型顯示，F(xiàn)PG高于正常范圍的人相對(duì)于FPG在正常范圍的人，發(fā)生脂肪肝的風(fēng)險(xiǎn)增加（OR=47.67，95%CI：5.95～381.69）。這個(gè)結(jié)果提示生化指標(biāo)的異常并不能完全作為脂肪肝的危險(xiǎn)因素，脂肪肝的形成可能使多個(gè)遺傳基因和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。單個(gè)基因的作用可能具有局限性。但基因的突變很有可能是更加危險(xiǎn)的因素，需要在后續(xù)的檢測(cè)中給與一定的權(quán)重。

目前一些專(zhuān)家認(rèn)為對(duì)脂肪性肝病的命名并不準(zhǔn)確，他們認(rèn)為脂肪肝的形成涉及人體整體代謝，并與遺傳和環(huán)境因子相關(guān)[27-28]，這與中醫(yī)的整體觀念和ZJU指數(shù)的多指標(biāo)復(fù)合相契合。筆者認(rèn)為將遺傳背景因素納入到ZJU指數(shù)的研究具有積極意義，可以作為中醫(yī)證型客觀化的潛在研究指標(biāo)。但由于ZJU指數(shù)與糖脂代謝及肝功有關(guān)，在納入基因上，可能需要與這些指標(biāo)相關(guān)。例如，本研究選擇的脂聯(lián)素（Adiponectin，APN）基因又稱(chēng) 28ku膠原結(jié)合蛋白（GBP28），是一種由脂肪組織合成并分泌的蛋白質(zhì)類(lèi)激素，具有緩解胰島素抵抗、降低細(xì)胞內(nèi)甘油三酯（TG）的作用，提示APN通過(guò)影響機(jī)體胰島素抵抗機(jī)制從而影響FLD痰瘀證型的發(fā)生與發(fā)展。瘦素（Leptin，LEP）是由脂肪組織分泌的蛋白質(zhì)類(lèi)激素，其分泌量與人體的體脂含量成正比。臨床研究也表明，高LEP水平可降低胰島素抵抗、減少肝細(xì)胞的脂肪變性[29]。瘦素受體（Leptin receptor，LEPR）屬Ⅰ類(lèi)細(xì)胞因子受體家族，可通過(guò)與瘦素結(jié)合，為瘦素發(fā)揮生理功能起介導(dǎo)作用。LEP信號(hào)對(duì)胰島素具有拮抗作用，若其作用受到抑制，則可誘發(fā)胰島素抵抗、促使肝細(xì)胞脂肪變性的發(fā)生，提示LEP與LEPR可能與脂肪肝痰瘀證型具有相互關(guān)系。馬鈴薯糖蛋白樣磷酸酶（PNPLA3）又稱(chēng)為脂肪營(yíng)養(yǎng)素重組蛋白，該基因編碼了一個(gè)由481個(gè)氨基酸組成表達(dá)于與脂滴直接接觸的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的跨膜蛋白。過(guò)量游離脂肪酸存在的條件下，人肝細(xì)胞過(guò)表達(dá)PNPLA3突變型可減緩細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的水解速度，促進(jìn)甘油三酯在肝內(nèi)的沉積[11-14]。該基因的突變所導(dǎo)致的病理產(chǎn)物也與痰瘀證候相關(guān)。但是，由于ZJU指數(shù)涉及的代謝過(guò)程及基因較多，若考慮中醫(yī)分型的準(zhǔn)確性，則需要在更大樣本范圍的基礎(chǔ)上評(píng)估納入的基因數(shù)量，并進(jìn)行權(quán)重優(yōu)化。后續(xù)筆者團(tuán)隊(duì)將擴(kuò)大樣本量，充分研究ZJU指數(shù)和基因多態(tài)性聯(lián)合對(duì)中醫(yī)證型的指導(dǎo)作用，讓該指數(shù)可以作為中醫(yī)證型客觀化的參考指標(biāo)。