氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定富勒烯中痕量苯殘留

錢 沖 胡光輝,2 勾新磊 劉偉麗,2 高 峽,2 張 梅,2*

(1. 北京市理化分析測(cè)試中心，有機(jī)材料檢測(cè)技術(shù)與質(zhì)量評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京 100089；2.北京市食品安全分析測(cè)試工程技術(shù)研究中心，北京 100089)

作為碳的一種同素異形體，富勒烯是由五邊形和六邊形組成的籠狀結(jié)構(gòu)全碳分子[1]。C60、C70富勒烯是最為常見的種類，也是理化性質(zhì)最穩(wěn)定、研究最為廣泛的兩種富勒烯。其中，C60是最小的遵守獨(dú)立五元環(huán)規(guī)則的富勒烯，具有類似足球一樣完美對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，其合成產(chǎn)率也最高[2]。大量的研究發(fā)現(xiàn)，富勒烯材料在超導(dǎo)、磁性、光學(xué)、催化、生物等方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，并已在生物醫(yī)藥、新能源、新材料等領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng)用[3-7]。特別是富勒烯分子獨(dú)特的π電子結(jié)構(gòu)以及低電子重組能、高電子遷移率等，使其成為醫(yī)學(xué)診斷及治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重要的功能原材料。

經(jīng)過三十余年的發(fā)展，富勒烯的合成方法日益完善，包括火焰燃燒法、電弧放電法、石墨電阻蒸發(fā)法、激光蒸發(fā)法等[8, 9]，各種方法的工藝條件不一樣，產(chǎn)量和純度等也不盡相同。絕大多數(shù)方法合成的初產(chǎn)物為C60、C70等多種富勒烯與其副產(chǎn)物的碳灰混合物，成分非常復(fù)雜，由于不同富勒烯彼此間的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)十分相似，如何對(duì)富勒烯的碳灰產(chǎn)物進(jìn)行高效提取和分離是影響富勒烯發(fā)展的重要技術(shù)挑戰(zhàn)。只有將合成的富勒烯進(jìn)行有效提取和分離，才能進(jìn)一步對(duì)其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行深入研究，為進(jìn)一步拓展富勒烯的應(yīng)用提供基礎(chǔ)[10-12]。

在富勒烯的分離、提取及改性研究中，芳香苯類化合物是最為常用的有機(jī)溶劑，特別是苯作為芳香族有機(jī)溶劑的典型代表被廣泛使用。由于苯環(huán)的結(jié)構(gòu)與富勒烯較為相似，苯在富勒烯的分離提取過程中難以被完全去除，這導(dǎo)致其在最終的富勒烯產(chǎn)品中不可避免地殘留。然而，作為一類致癌物，苯的毒性較大，會(huì)對(duì)人體的呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)造成損害，并影響人體的造血和免疫機(jī)能，嚴(yán)重威脅人類生命健康[13]。因此，對(duì)富勒烯中苯殘留進(jìn)行有效分析與監(jiān)測(cè)是保障產(chǎn)品安全性能的必要手段，對(duì)推動(dòng)富勒烯在更多領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。

目前，關(guān)于苯殘留檢測(cè)的相關(guān)研究主要集中在化工、環(huán)境、食品等領(lǐng)域[14-16]，而關(guān)于富勒烯中苯殘留的分析方法還鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)是苯殘留檢測(cè)最常用的方法[17,18]，這兩種方法的缺點(diǎn)在于靈敏度較低、受基質(zhì)干擾影響大，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。相比而言，氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)通過二次打碎母離子，生成特異性更強(qiáng)的子離子，能夠在很大程度上提高檢測(cè)方法的靈敏度、降低基質(zhì)干擾，有效避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)[19,20]，這也為富勒烯中苯殘留的分析提供了可能。本研究選取靈敏度高且基質(zhì)效應(yīng)小的GC-MS/MS法，建立了測(cè)定C60、C70富勒烯中痕量苯殘留的分析方法，并開展了相關(guān)方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果將為富勒烯中其它溶劑殘留的檢測(cè)技術(shù)提供借鑒，為富勒烯的應(yīng)用特別是藥物臨床前的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供重要技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(GCMS-TQ8040)，GCMSsolution 4.30工作站，日本Shimadzu公司；渦旋混合器(Vortex-genie 2)，美國Scientific Industries公司；超聲清洗器(KQ-300DE)，中國昆山舒美公司；電子天平(XPE105)，瑞士Mettler Toledo公司；甲醇(色譜純)，美國Thermo Fisher Scientific公司；苯標(biāo)準(zhǔn)品溶液(1000 μg/mL)，美國Accustandard公司；C60富勒烯(批號(hào)：SES60F2018020203)、C70富勒烯(批號(hào)：SES70F2017073104)，由中科院化學(xué)所提供，用于方法學(xué)驗(yàn)證；其它C60、C70富勒烯樣品均購自市場(chǎng)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

取濃度為1000 μg/mL苯標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，用甲醇將其逐級(jí)稀釋至濃度分別為3.00、10.00、20.00、40.00、200.00、400.00 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 儀器工作條件

GC條件：DB-5 MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度250℃；載氣為He。進(jìn)樣量1.0 μL，分流比5:1，柱流量1.0 mL/min。升溫程序：初始柱溫在50 ℃保持1 min，經(jīng)20 ℃/min升至100 ℃，之后30 ℃/min升至280 ℃并保持2 min。

MS/MS條件：電子轟擊離子源(EI)，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃；接口溫度280 ℃，溶劑延遲時(shí)間0.5 min，采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。保留時(shí)間和MRM條件參數(shù)見表1所示。

表1 苯保留時(shí)間及MRM條件參數(shù)

1.4 樣品處理

稱取C60、C70富勒烯樣品100 mg置于2 mL離心管中，加甲醇1 mL，渦旋震蕩混勻后，置于超聲清洗器中超聲提取40 min并搖勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。取濾液作為供試品溶液，按照儀器工作條件對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

圖1為苯和甲醇的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖。苯的一級(jí)特征碎片離子(母離子)質(zhì)荷比較小，因此提取溶劑的選擇應(yīng)具備以下條件：首先能夠與苯互溶，苯在其中應(yīng)有良好溶解度，以保證富勒烯中痕量苯殘留可以被提取完全；其次分子量不宜過大，若提取溶劑的分子量太大，其母離子及相應(yīng)的子離子會(huì)干擾苯的測(cè)定。

圖1 苯(a)和甲醇(b)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖

甲醇是常用的分子量最小的有機(jī)提取溶劑，并且與苯有良好互溶性，其最大母離子的質(zhì)荷比為32 m/z，很難再二次打碎生成相應(yīng)子離子，不會(huì)對(duì)苯的檢測(cè)造成干擾。因此，實(shí)驗(yàn)選擇甲醇作為提取溶劑。

2.2 色譜及質(zhì)譜條件的選擇

為縮短檢測(cè)周期，本實(shí)驗(yàn)僅在初始柱溫50 ℃下保持了1 min，便以20 ℃/min的速度升值100 ℃。當(dāng)柱溫達(dá)到該溫度時(shí)，苯已出峰完全，此時(shí)繼續(xù)提高升溫速率，以30 ℃/min的快速升值280 ℃，并在該溫度下保持了2 min。這不僅減少了程序升溫的時(shí)間、提高了檢測(cè)效率，同時(shí)還達(dá)到了老化色譜柱的效果。

實(shí)驗(yàn)選擇苯的質(zhì)核比較大的一級(jí)特征碎片離子78和77 m/z作為母離子，進(jìn)行碰撞能優(yōu)化，并選擇豐度較高、質(zhì)核比較大的子離子進(jìn)行定性與定量分析。如表1所示，實(shí)驗(yàn)選擇78.00>52.10 m/z作為定量分析離子對(duì)，選擇77.00>51.10 m/z和78.00>39.10 m/z作為定性分析離子對(duì)。

2.3 方法專屬性

針對(duì)方法的專屬性進(jìn)行考察，按照試驗(yàn)方法分別對(duì)甲醇空白溶劑、苯標(biāo)準(zhǔn)溶液(200 μg/L)、C60富勒烯供試品溶液(100 mg/mL)、C70富勒烯供試品溶液(100 mg/mL)進(jìn)行檢測(cè)分析。

如圖2和圖3所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明苯的色譜峰型及響應(yīng)性均良好，甲醇、樣品中其它成分未對(duì)苯的檢測(cè)造成干擾。這表明本分析方法具有良好的專屬性，可以滿足C60、C70富勒烯中痕量苯殘留的檢測(cè)要求。

圖2 甲醇空白溶劑(a)和苯標(biāo)準(zhǔn)溶液(b)選擇離子流圖

圖3 C60(a)和C70(b)富勒烯供試品溶液選擇離子流圖

2.4 檢出限、定量限和線性范圍

按照試驗(yàn)方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定，分別以苯定量離子對(duì)78.00>52.10 m/z峰面積(y)和對(duì)應(yīng)的濃度(x，μg/L)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)。分別以10倍信噪比(S/N>10)和3倍信噪比(S/N>3)計(jì)算出儀器的的定量限和檢出限，再按1.4樣品的處理方式換算出苯的方法定量限與方法檢出限。

分析結(jié)果如表2和圖4所示，苯在3～400 μg/L濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)(r2)為0.9999，方法檢出限和定量限分別為9.00 μg/kg、30.00 μg/kg。

表2 苯的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

圖4 苯的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 超聲提取時(shí)間的選擇

分別稱取C60、C70富勒烯100 mg，置于2 mL離心管中，加入甲醇1 mL，渦旋震蕩混勻。分別平行制備7份，置于超聲清洗器中，分別超聲提取0、5、10、20、40、60、90 min后搖勻，并經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，取濾液進(jìn)行檢測(cè)分析。

表3為C60、C70富勒烯分別經(jīng)不同超聲時(shí)間提取后苯含量的檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，C60富勒烯超聲時(shí)間小于10 min時(shí)未檢出苯；超聲時(shí)間為20 min時(shí)，苯含量為6.58 μg/kg，小于方法檢出限9.00 μg/kg；超聲時(shí)間為40min時(shí)，苯含量為48.31 μg/kg；當(dāng)超聲時(shí)間大于40 min時(shí)，苯的檢測(cè)結(jié)果趨于穩(wěn)定。

表3 超聲提取時(shí)間優(yōu)化結(jié)果 苯含量，μg/kg

對(duì)于C70富勒烯，當(dāng)其超聲時(shí)間小于40 min時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，苯的檢測(cè)結(jié)果呈逐漸增加趨勢(shì)；當(dāng)超聲提取時(shí)間大于40 min時(shí)，苯的檢測(cè)結(jié)果也趨于穩(wěn)定。因此，本方法優(yōu)選的C60、C70富勒烯的超聲提取時(shí)間為40min。

2.6 系統(tǒng)適應(yīng)性

實(shí)驗(yàn)配制濃度200.00 μg/L的苯標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)測(cè)定6次，以苯定量離子對(duì)78.00>52.10 m/z峰面積的RSD%值來考察方法的系統(tǒng)適應(yīng)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4所示，苯標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)六次測(cè)得峰面積的RSD%值為0.95%，表明方法具有良好的系統(tǒng)適應(yīng)性。

表4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.7 重復(fù)性和中間精密度

實(shí)驗(yàn)配制C60、C70富勒烯供試品溶液，分別平行配制6份，并按照試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)分析，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。C60、C70富勒烯6次檢測(cè)結(jié)果的平均值分別為48.34 μg/kg和750.04 μg/kg，對(duì)應(yīng)的RSD%值分別為4.81%、1.35%。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

此外，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了不同時(shí)間、不同實(shí)驗(yàn)人員在同一臺(tái)儀器上的數(shù)據(jù)重復(fù)性，通過重復(fù)上述試驗(yàn)步驟，并以苯6次檢測(cè)結(jié)果與重復(fù)性項(xiàng)進(jìn)行比較。以苯12次測(cè)得含量的RSD%值考察方法的中間精密度，結(jié)果見表6所示。C60、C70富勒烯中苯殘留的12次檢測(cè)結(jié)果的平均值分別為48.28 μg/kg和750.26 μg/kg，對(duì)應(yīng)的RSD%值分別為4.48%、1.25%。

表6 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=12)

2.8 加標(biāo)回收率

實(shí)驗(yàn)配制苯濃度分別為160.00、200.00、240.00 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別稱取C60、C70富勒烯100 mg，置于2 mL離心管中。分別加上述配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，渦旋震蕩混勻后，超聲提取40分鐘并搖勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。取濾液作為加標(biāo)回收樣品溶液，配制成加標(biāo)濃度分別為1600.00、2000.00、2400.00 μg/kg的低、中、高濃度的加標(biāo)回收樣品溶液，每個(gè)加標(biāo)濃度平行配制6份進(jìn)行檢測(cè)分析。

以2.7小節(jié)重復(fù)性項(xiàng)中C60、C70富勒烯苯殘留檢測(cè)結(jié)果的平均值(分別為48.34 μg/kg和750.04 μg/kg)作為本底值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)際測(cè)得加標(biāo)回收樣品的結(jié)果與理論添加量的比，計(jì)算加標(biāo)回收率和RSD%值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7所示，苯不同濃度加標(biāo)回收率在94.39%～96.45%之間，對(duì)應(yīng)的RSD%值在1.15%～1.41%之間。

表7 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.9 樣品分析

從市場(chǎng)采購了3種C60富勒烯和2種C70富勒烯樣品，按照本試驗(yàn)方法對(duì)其中的苯殘留量進(jìn)行分析測(cè)定。檢測(cè)結(jié)果如表8所示，市售的C60、C70樣品中均未檢測(cè)出苯，苯殘留量均低于方法檢出限9.00 μg/kg。

表8 市售C60、C70富勒烯樣品的檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

C60和C70富勒烯理化性質(zhì)穩(wěn)定、產(chǎn)率高，被廣泛應(yīng)用于化工、生物醫(yī)學(xué)、化妝品等眾多領(lǐng)域。目前，藥物分析中對(duì)苯的殘留量有明確的限量規(guī)定，關(guān)于富勒烯作為最有潛力的藥物材料之一，其中苯殘留的分析方法尚鮮有報(bào)道，亟需明確并建立C60、C70富勒烯中苯殘留的分析測(cè)試方法。本工作探索并建立了基于GC-MS/MS測(cè)定C60、C70富勒烯中痕量苯殘留的方法，并系統(tǒng)開展了相關(guān)方法學(xué)驗(yàn)證。研究結(jié)果表明，該方法的選擇性好、靈敏度高、分析速度快，并且操作便捷、檢測(cè)成本低，可廣泛應(yīng)用于C60、C70富勒烯樣品中痕量苯殘留的定量及定性檢測(cè)。研究結(jié)果將有助于指導(dǎo)富勒烯中其它殘留組分的測(cè)定，對(duì)富勒烯的應(yīng)用推廣特別是藥物臨床前的質(zhì)量評(píng)價(jià)具有重要意義