黃原膠對扁桃仁蛋白質乳化特性的影響

徐瑋鍵，王煒清，余雄偉，付琴利，陳歷水，李述剛,,

（1.合肥工業大學食品與生物工程學院，安徽合肥 230601；2.湖北工業大學發酵工程教育部重點實驗室，湖北武漢 430068；3.武漢旭東食品有限公司，湖北武漢 430000；4.湖北良品鋪子食品工業有限公司，湖北武漢 430000）

扁桃（Amygdalus communisL.），為薔薇科（Rosaceae）李亞科（Prunoideae）李屬（Prunus）桃亞屬（Amygdalus）的干旱亞熱帶、暖溫帶半荒漠灌木或中型喬木植物，是世界著名干果及木本油料樹種[1?2]，全球扁桃約有2000多個品種[3]。扁桃仁蛋白質（Almond protein isolate，API）的氨基酸組成合理、含量豐富，為一種全價蛋白質，其中必需氨基酸組成比例符合FAO/WHO推薦的模式[4?5]。

大豆、花生、核桃和扁桃等植物源蛋白質不僅營養豐富，而且風味上乘，已在食品飲料領域得到廣泛應用，極大地促進和繁榮了該產業發展[6]。近年來，扁桃仁蛋白質乳飲料還因其獨特的風味倍受消費者的青睞，然而一直以來，乳化性及乳化穩定性較差問題始終是困擾其開發利用的技術瓶頸[7]，因此研究攻克該技術難題具有重要的科學價值及市場前景。蛋白質、多糖等生物大分子因其特有的分子屬性使其具有良好的乳化性和增稠性[8]，可通過形成特有的網絡結構有效改善乳液體系中的連續相黏度，從而抑制乳液析出或沉降，已在豆奶、花生乳、核桃乳和杏仁乳中得到廣泛運用[9]。黃原膠（Xanthan gum，XG）是一種陰離子多糖，因其具有良好的穩定性、乳化性、增稠性、懸浮性和安全性而被廣泛應用于食品、醫藥和化工等領域[10]。

因此，為解決扁桃仁蛋白質乳化穩定性，本試驗以扁桃仁蛋白質為研究對象，在對比明膠、殼聚糖等生物大分子對其乳液乳化特性影響的基礎上，重點探討了黃原膠對其乳化及乳化穩定性的影響規律。研究旨在為扁桃蛋白質的應用開發提供新思路，進而擴展其應用領域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

扁桃 新疆莎車縣；中鏈甘油三酯（MCT） 食品級，99.9%，馬來西亞KLK OLEO公司；黃原膠分析純，國藥集團化學試劑有限公司；尼羅藍、尼羅紅 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

TRACKER界面流變儀 法國TECLIS界面技術有限公司；Mastersizer 2000型激光粒度儀 英國Malvern公司；PT-MR 2100型高速剪切乳化機 瑞士Kinematica公司；Zetasizer Nano-ZS型納米粒度及電位滴定儀 英國馬爾文（Malvern）公司；Haake Rheostress6000型旋轉流變儀 美國Thermo Fisher公司；D-Eclopse C180i熒光顯微鏡 美國Nikon公司；TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；NOVEL百特圖像顆粒分析儀分析系統 丹東百特科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 扁桃仁蛋白的提取 參照Liu等[11]的方法并稍作修改，扁桃仁脫脂粉溶于超純水中（1:30，g/mL）并調節pH至9.5，在35 ℃條件下攪拌3 h后以8000×g離心20 min。將上清液pH調至4.5，靜置15 min后在4 ℃條件下8000×g離心20 min，水洗沉淀2次。將沉淀物分散于超純水中并調節pH至7.0，并在4 ℃條件下進行透析3 d，冷凍干燥得蛋白粉。

1.2.2 生物大分子的選擇 多糖、蛋白質等生物大分子因其特有的大分子網絡結構可顯著改善和提高乳液的黏度和穩定性等。溶液A類：單獨扁桃仁蛋白（API）溶液；混合物B類：蛋白質、多糖（明膠、乳糖、卡拉膠、瓊脂、海藻酸鈉、殼聚糖、魔芋膠、葡萄糖、阿拉伯膠、黃原膠、菊粉及CMC）；乳液C類：將API溶液分別與各多糖溶液混勻。

分別將API、蛋白質和多糖分散在蒸餾水中，攪拌6 h并在4 ℃下儲存過夜以確保完全分散來制備溶液A類（1%）和混合物B類（0.2%），其中混合物CMC濃度分別為0.7%、0.9%、1.2%。API濃度為1%，蛋白質或多糖濃度為0.2%，油相MCT為20%，剪切條件為16000 r/min條件下混合3 min制備乳液C類。所有樣品制備后在25 ℃下放置并觀察其乳析變化。

1.2.3 扁桃蛋白-黃原膠溶液及乳液的制備 制備扁桃仁蛋白（API）溶液（2%）與黃原膠（XG）溶液（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）。再將API母液與XG母液以1:1比例混合，最終制備出API濃度為1%，XG濃度分別為0%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%的API-XG乳液，調pH至中性，室溫下攪拌混勻。配制API、API-XG乳液并添加20%MCT得到扁桃蛋白-黃原膠乳液。乳液中添加0.02%疊氮化鈉以防止微生物生長，4 ℃下密封放置。

1.2.4 界面張力 利用Tracker界面流變儀，在25 ℃下測量API、API-XG乳液在油-水界面上表面張力隨時間的變化，測試時間為10800 s。

1.2.5 乳液粒度 采用馬爾文粒度分析儀測定，泵的轉速為2000 r/min，分散相為MCT，連續相為水；折射率為1.330；樣品折射率設為1.414，吸收率為0.001。結果分析得出乳液液滴的體積分布、表面積加權平均直徑D[3,2]與體積加權平均直徑D[4,3]。各樣品平行測定三次，最后取平均值。

1.2.6 乳液ζ-電勢 用納米粒度電位儀測定乳液液滴的表面電荷分布。將乳液稀釋適當的倍數，置于電位槽中進行測定。測定中連續相選擇water、分散相選擇MCT。

1.2.7 乳液流變學特性 通過Haake Rheostress 6000型流變儀測定乳液流變特性，采用圓錐直徑60 mm的幾何椎板鈦合金轉子（型號：C60Til，圓錐角度1°，測量間距0.052 mm）。

1.2.7.1 穩態剪切黏度測量 通過循環水浴設定實驗溫度為25.0±0.2 ℃。實驗參數：固定振幅1%，在0.1~10 Hz范圍進行頻率掃描，設定對數模式采集數據。

1.2.7.2 動態溫度掃描 實驗過程中加蓋密封圈并添加適量的硅油以避免水分過度蒸發。振幅為1%，溫度以2 ℃/min由25 ℃升溫至90 ℃，檢測整個過程中乳液體系的變化。

1.2.8 乳液的微觀結構觀察 根據的Zhang等[12]的方法，利用熒光顯微鏡對乳液進行顯微觀察。

1.2.9 層析指數 根據鄧欣倫[13]的方法，并稍作修改。取一定量的乳液加入乳析管室溫下靜置后計算層析指數CI（Creaming Index）。式中：CI表示層析指數，%；HS表示清液層的高度，mm；HT乳液總高度，mm。

1.2.10 乳液穩定性

1.2.10.1 儲藏穩定性 常溫儲藏實驗：乳液放置在常溫（25 ℃）環境中儲藏，0、1、3、5、7、9、11、13、15 d取樣測定乳液粒徑變化。加速儲藏實驗：乳液放置在高溫（60 ℃）環境中儲藏，0、1、3、5、7 d取樣測定乳液粒徑變化，測定方法同1.2.6。

1.2.10.2 熱穩定性 根據Chen等的方法，并稍作修改[14]。取不同樣品的乳液（5 mL）于水浴鍋中，90 ℃條件下加熱30 min后取出，冷卻至室溫，放置24 h后測定乳液性質。

1.2.10.3 凍融循環 根據Chen等的方法，并稍作修改[14]。取不同樣品的乳液（5 mL）分別裝于10 mL離心管中，放置在?20 ℃的冰箱中冷凍24 h，取出乳液樣品解凍并在25 ℃放置24 h，循環三次，測定乳液性質。

1.2.10.4 Na+環境 根據的Zhang等的方法，并稍作修改[12]。制備API-XG乳液，分別加入0、50、100、250 mmol/L NaCl，室溫（25 ℃）存放0、24 h后測定乳液的粒徑、ζ-電位、層析指數。

1.3 數據處理

每個實驗重復3次，數據以均值±標準差表示，采用Origin 8.0軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 多糖/蛋白質生物大分子篩選

多糖、蛋白質等生物大分子因其特有的大分子網絡結構可顯著改善乳液的黏度和穩定性等。為探討不同多糖和蛋白質對API的乳化效果，本實驗分別選用明膠、黃原膠、卡拉膠等生物大分子制備API乳液。如圖1混合物B類所示，大多數多糖、蛋白質的乳化性較差，只能包裹住極少部分的油滴，大部分油滴漂浮在乳液層上方，其中黃原膠、魔芋膠的乳化性較好。如圖1乳液C類所示，除API-XG乳液外其余樣品在存放3 d后均出現不同程度的乳析現象。因此，根據乳化性及乳液穩定性綜合考慮，選用黃原膠進行下一步研究。

圖1 多糖/蛋白質篩選效果圖Fig.1 Effect picture of polysaccharide/protein screening

2.2 XG對API乳液性質影響

2.2.1 乳液的界面張力 乳液的界面張力是衡量乳液穩定性的重要指標，乳液界面張力越小，其乳化穩定性越好。如圖2可知，隨XG添加量的增加，其界面張力逐漸減小，即未添加XG時其溶液的界面張力達到13.1 mN/m，明顯高于API-XG乳液；在XG添加量為0.25%時，AIP-XG乳液其界面張力最小，其數值僅為5.6 mN/m，其原因可能是因為隨著XG濃度的增加，API-XG乳液體系的不相容性增加，API結構發生變化，疏水性基團暴露，有利于蛋白與油相相互作用[15]。因此，XG的添加有利于提高API乳液的乳化穩定性，當XG添加量為0.25%時效果最好。

圖2 API、API-XG乳液界面張力隨時間的變化Fig.2 Changes of surface tension of API, API-XG emulsion with time

2.2.2 乳液粒徑、Zeta-電位 乳液穩定性可以通過其尺寸和分布來表征，D[4,3]反映蛋白質的乳化能力，D[4,3]越小，其乳化能力越好[16]。如圖3A所示，未添加XG的溶液粒徑集中分布于10~100 μm，隨XG添加量的增加，乳液液滴粒徑逐漸減小，且液滴分布更為集中。如圖3B所示，未添加XG的溶液D[4,3]約為34.7 μm，隨XG添加量的增加，乳液的D[4,3]逐漸下降至20.9 μm左右，且下降速度逐漸減緩。這可能是因為XG提高了乳液體系的黏度，并降低了液滴的絮凝速率[17]。這表明XG對液滴尺寸的減小具有積極作用。

圖3 XG添加量對API乳液粒徑分布（A），D[4, 3]與ζ-電位（B）的影響Fig.3 Effect of XG concentration on API emulsion particle size distribution（A）, D [4, 3] and zeta potential（B）

復合物的表面電荷密度反映蛋白質和多糖之間的靜電相互作用，同時Zeta-電位通過反映液滴間的帶電性質表征乳液的穩定性，即Zeta-電位絕對值越高，乳液越穩定。從圖3B所示，隨著XG濃度的增加，API-XG乳液的電位絕對值逐漸增大，當XG添加量達到0.25%時，其電位絕對值達到54.4 mV。這是由于在中性條件下，API與XG均攜帶負電荷，兩種生物大分子在體系中共存而沒有發生靜電吸引作用，則電位絕對值隨XG濃度增加而增加[18?19]。API-XG形成的復合吸附物使得吸附層的負電荷增加，乳液液滴間排斥作用增強，乳液的物理穩定性也越好。因此，XG的添加可以改善API乳液的穩定性。

2.2.3 乳液表觀黏度 乳液的表觀黏度隨剪切速率的增大而減小，在達到較高剪切速率時趨于定值，呈現出剪切稀化的現象[20]。如圖4所示，隨著黃原膠濃度的增加，剪切稀化程度加劇，這可能是因為當耗盡絮凝和剪切速率大到足以克服布朗運動時，乳液變得更有序，表現出的阻力更小[21]。未添加XG溶液的表觀黏度約為5.9 mPa·s，與其相比，API-XG乳液的表觀黏度隨XG添加量的增加明顯增加，最高可達到77.5 mPa·s。這是由于API-XG復合物可以在油滴表面形成界面層，提供較強的空間穩定作用，在流動模式下，當帶電液滴接近其他帶相似電荷的液滴時，由于靜電排斥作用會改變路徑繞過其他的液滴，從而增加了流動的阻力[22]。因此，XG的添加有利于改善乳液的表觀黏度。

圖4 XG添加量對API乳液黏度的影響Fig.4 Effect of XG concentration on API emulsion viscosity

2.2.4 乳液的動態溫度掃描 G′反映乳液的彈性性質，G′′反映乳液的黏性性質[23]。如圖5A確定固定應變10%，圖5B所示，單獨0.25% XG溶液的G′與G′′值較大，在加熱過程中儲存模量G′始終大于損耗模量G′，這表明樣品具有凝膠狀的性質，網絡結構良好。圖6為不同XG添加量下API乳液在加熱過程中粘彈性的變化，單獨API溶液的G′與G′′值較小，大多1 Pa以下，隨XG添加量的增加，乳液的粘彈性逐漸增強，且其G′隨溫度升高呈先降低后上升的趨勢，API-0.25% XG乳液的G′與G′′值最大，這可能是由于未吸附的XG在連續相中形成凝膠狀結構，促進了乳液的彈性結構，XG較好的凝膠能力使混合體系顯示出凝膠特性[24]。

圖5 API乳液的應力掃描（A）；在升溫過程中0.25%XG溶液儲能模量（G′）和損耗模量（G′′）的變化（B）Fig.5 Stress scanning of API emulsion (A); During the heating process, energy storage modulus (G′) and loss modulus (G′′)change of 0.25% XG solution (B)

圖6 API、API-XG乳液儲能模量（G′）和損耗模量（G′′）的變化Fig.6 Energy storage modulus (G′) and loss modulus (G′′) changes of API, API-XG emulsion

2.2.5 乳液微觀結構 熒光顯微鏡圖片可直觀地表現乳液的液滴分布情況，如圖7所示。單獨API溶液不規則的黑色區域較多，這是油滴間架橋絮凝作用的結果；API-XG乳液液滴粒徑大小分布更均勻，液滴直徑更小，脂肪球數量減少。這表明API-XG乳液比單獨的API溶液更穩定，這是由于XG形成的高粘性網絡阻止了液滴的聚集[25]，因此，XG的添加有效增強了API的乳化能力。

圖7 XG添加量對API乳液熒光微觀結構的影響Fig.7 Effect of XG addition on fluorescence microstructure of API emulsion

2.3 乳液穩定性分析

2.3.1 儲藏穩定性 如圖8、圖9所示，所有乳液粒徑均隨儲藏時間的增加而增大，這是因為液滴表面蛋白質分子的重新排列或解吸，改變了乳液的界面性質[26]，其中單獨API溶液在儲藏第1 d就出現了明顯的層析和沉淀現象；當XG添加至0.15%時，乳液呈現出較好的長期穩定性。在此基礎上研究發現XG添加量在（0.2%~0.25%）時乳液粒徑增加，但未出現明顯的乳析或相分離現象，說明此時乳液仍比較穩定。這是由于黃原膠的添加使乳液體系的黏度提高，對體系的分層現象有一定的抑制作用[27]；由此可知，乳液在25和60 ℃儲藏時，XG添加量在0.2%及0.25%時乳液穩定性相對較好。

圖8 乳液的25 ℃儲藏穩定性Fig.8 Storage stability of the emulsion at 25 ℃

圖9 乳液的60 ℃儲藏穩定性Fig.9 Storage stability of emulsion at 60 ℃

2.3.2 乳液的熱穩定性 熱處理對乳液的穩定性有著重要影響。本研究模擬了實際生產中使用的熱處理工藝，對樣品進行90 ℃加熱處理，以闡明熱處理A10對乳液的影響。如圖10所示，樣品經加熱處理并放置24 h后，乳液液滴發生了不同程度的聚集，粒徑增加，未添加XG溶液的D[4,3]從34.7 μm增加至53.6 μm。隨XG添加量的增加（0.05%~0.15%），乳液粒徑增加幅度降低，這可能是由于API-XG復合物在高溫下形成一個界面層抑制絮凝作用；有研究報道，陰離子多糖（如XG）可以改善乳液的熱穩定性[28]。當XG增加至0.2%~0.25%時，無法對API-XG乳液的粒徑進行測量。這是由于XG自身具有一定的凝膠特性，XG的添加使API乳液粘彈性發生改變，在加熱過程中，API發生變性，且在XG的作用下，乳液在冷卻后形成凝膠。

圖10 熱處理對乳液穩定性的影響Fig.10 Effect of heat treatment on emulsion stability

2.3.3 凍融循環對乳液穩定性的影響 在食品的加工、儲藏及運輸中，難免會經歷溫度劇烈起伏波動影響，本實驗通過模擬凍融循環以探究乳液在其環境下的穩定性。如圖11所示，經24 h處理后的乳液粒徑分布范圍變大，平均粒徑明顯增大，未添加XG的API溶液在經過凍融循環處理后出現破乳現象。如圖11B、C所示，放置24 h后，隨XG添加量的增加，API-XG乳液粒徑增加幅度逐漸減小；當XG添加量為0.15%時，乳液未出現乳析或相分離現象，說明API-0.15% XG乳液相對穩定；繼續添加XG（0.2%~0.25%），乳液粒徑變化相對較小，且無乳析等現象。這可能是由于添加0.2%~0.25% XG時的乳液黏度較大，且ζ-電位值更低，具有更強的靜電排斥作用，從而增加了乳液的穩定性[14]。

圖11 凍融循環對乳液穩定性的影響Fig.11 Effect of freeze-thaw cycle on emulsion stability

2.3.4 Na+對乳液穩定性的影響 食品的加工中可能會有不同的鹽離子干擾，本實驗模擬Na+環境對乳液穩定性的影響。圖12A表明隨Na+濃度增加，API乳液的粒徑增大，這可能是由于鹽離子會改變多糖在體系中的狀態，溶液電解質減弱體系中未吸附多糖的水化作用，增加自由水的釋放，使黏度降低，液滴間靜電斥力減弱，乳液液滴發生聚集導致粒徑變大[29]。圖12B可看出隨著鹽離子濃度的增加，ζ-電位減?。ń^對值）。根據圖12C層析指數與圖12D的宏觀圖可看出，當添加XG（0.1%~0.15%）時，乳液只在添有250 mmol/L Na+環境中出現分層；當XG達到0.2%時，未出現乳液層析現象?？梢?，XG添加量達到0.15%~0.25%時，API-XG乳液在Na+環境中的穩定性較好。

圖12 Na+對乳液穩定性的影響Fig.12 Influence of Na+ on emulsion stability

3 討論與結論

本實驗在多糖種類篩選的基礎上系統探討了黃原膠添加量對API乳化性及乳液穩定性的影響。結果表明：對比發現XG對API乳化特性影響最明顯，即添加XG可有效改善API的乳化性與乳液穩定性；XG的添加使API-XG乳液的黏度增加，表面張力降低，界面吸附能力增強，具有更低的電位值，液滴直徑小且分布更均勻，且當XG添加量為0.25%時效果最明顯；XG的適度添加（0.15%~0.20%）使APIXG乳液的熱穩定性、耐鹽性有所提升，當XG添加量為0.2%~0.25%時，API-XG乳液在儲藏及凍融循環條件下表現出良好的穩定性。因此，當XG添加量為0.2%時，API乳液具有較優的乳化性及乳液穩定性。扁桃仁分離蛋白質是一種優質的植物蛋白質資源，然其乳化特性一直是制約其開發利用的重要影響因素，本實驗以黃原膠為輔助材料，實驗結果有效提升了其乳化性和乳化穩定性。但就黃原膠改善扁桃仁分離蛋白質乳化特性的影響機制尚不明確，且對兩者相互作用后的營養與功能挖掘也有待進一步探究。