高產(chǎn)高純度果膠甲酯酶黑曲霉工程菌的構(gòu)建

韓萌萌，蓋金明，姜慶豐，張 會，李 杰

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

果膠甲酯酶對果膠分子中的甲酯基團具有高度專一性，可以將其催化水解形成果膠酸，并釋放氫離子和甲醇。由于具有這一特性，果膠甲酯酶在工業(yè)當(dāng)中得到廣泛的應(yīng)用[1?2]。果膠甲酯酶可以將高酯果膠變成低酯果膠，低酯果膠是具有較高價值的工業(yè)原料[3]，低酯果膠還可作為藥物的組成成分，加快傷口愈合，減少血漿中的膽固醇。目前生產(chǎn)低酯果膠的最佳方法是果膠甲酯酶法生產(chǎn)，而低酯果膠產(chǎn)品的品質(zhì)高度依賴于果膠甲酯酶制劑的純度[4?6]。果膠甲酯酶還應(yīng)用于造紙工業(yè)的白水處理[7?8]，在飼料工業(yè)中它與其他酶系復(fù)合使用還可以提高飼料轉(zhuǎn)化利用率[9]。此外由于果膠甲酯酶在罐頭、果汁、泡菜等食品行業(yè)有較多的應(yīng)用[10?12]，因此，食品級果膠甲酯酶的需求量也在逐年增加，食品級果膠甲酯酶商品純度的要求也很高[13?14]。

目前市面上銷售的果膠甲酯酶多為黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)[15]，而黑曲霉在發(fā)酵生產(chǎn)果膠甲酯酶的過程當(dāng)中還同時分泌許多其他酶類，這就導(dǎo)致了在下游分離純化果膠甲酯酶的過程當(dāng)中產(chǎn)生產(chǎn)量的損失以及酶活的損耗[16?17]。同時分離純化的工藝步驟也大大增加了產(chǎn)酶的成本，使得果膠甲酯酶的價格較高，并且目前果膠甲酯酶的分離純化工藝也并不完善，最終的產(chǎn)品純度也得不到保證[18]，這對于一些高度依賴于果膠甲酯酶純度的產(chǎn)品的生產(chǎn)是不利的。所以，獲得高產(chǎn)高純度果膠甲酯酶的工程菌具有重大的商業(yè)價值[19?20]。

本實驗從果膠酶生產(chǎn)菌株黑曲霉種克隆了果膠甲酯酶基因pmeA，構(gòu)建了由PglaA6R啟動子和SglaA信號肽調(diào)控的表達載體pSZHG6R-pmeA，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化糖化酶生產(chǎn)菌黑曲霉TH-2，獲得高效分泌表達果膠甲酯酶的純合重組菌株TH-2（glaA::pmeA）。進一步通過敲除重組菌株TH-2（glaA::pmeA）中的asaA基因和優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，去除了背景蛋白，從而獲得了高產(chǎn)高純度果膠甲酯酶的工程菌。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉TH-2、黑曲霉果膠酶生產(chǎn)菌、農(nóng)桿菌AGL1、AGL1（pSZH-ΔpyrG）、AGL1（pSZHA-pyrG），大腸桿菌DH5α、載體pSZHG6R 由真菌遺傳研究室保存；限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA Ligase Takara公司；基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒 康為世紀公司；利福平、卡那霉素、氨芐霉素、乙酰丁香酮、PCR引物（表1） 生工生物公司。

表 1 PCR引物序列Table 1 PCR Primer sequence

PCR儀 杭州晶格科學(xué)儀器有限公司；T960型熱循環(huán)儀、SDS-PAGE電泳系統(tǒng) 美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；Mini-PROTEAN? Tetra蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；Tanon 2500R全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)、控溫水槽 上海博迅實業(yè)有限公司；DK-8D三溫三控水槽、紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司； UV-5800PC型紫外可見分光光度計、恒溫振蕩培養(yǎng)箱美國精騏科技與產(chǎn)業(yè)有限公司；IS-RDD3型臺式恒溫振蕩器、高壓蒸汽滅菌鍋 美國致微儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 果膠甲酯酶基因的擴增 依據(jù)黑曲霉pmeA基因組序列（Gene ID: 4980618），應(yīng)用軟件DNAMAN8.0設(shè)計用于擴增去除分泌信號肽編碼序列的pmeA基因引物P1、P2。提取黑曲霉果膠酶生產(chǎn)菌的基因組，用引物P1、P2進行PCR擴增，基因組提取實驗步驟和PCR擴增實驗步驟參照文獻[21]，回收約1300 bp的目的條帶，克隆測序，將測序正確的質(zhì)粒命名為pMD-pmeA。

1.2.2 表達載體的構(gòu)建 用XbaⅠ和HindⅢ雙酶切質(zhì)粒pMD-PmeA，回收約1300 bp的pmeA基因片段。用NheⅠ和HindⅢ雙酶切實驗室保存的pSZHG6R載體，回收載體片段。用T4DNA Ligase將這兩個片段23 ℃連接2 h，隨后將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，過夜培養(yǎng)，挑取單菌落提質(zhì)粒，XbaⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定表達載體pSZHG6R-pmeA是否構(gòu)建成功。

1.2.3 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 用凍融法將表達載體pSZHG6R-pmeA轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL1中[22?23]，用引物P3、P2進行菌落PCR鑒定。

1.2.4 黑曲霉轉(zhuǎn)化和純合轉(zhuǎn)化子鑒定 取勻漿后的新鮮黑曲霉TH-2菌絲與活化后的農(nóng)桿菌AGL1（pSZHG6R-pmeA）菌液各150 μL混合，涂布在貼玻璃紙的固體PDA平板培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)。待長出菌落，將玻璃紙及其上菌落翻轉(zhuǎn)倒扣在添加300 μg/mL潮霉素的 PDA平板上進行篩選。30 ℃培養(yǎng)1 d后，將玻璃紙揭下，繼續(xù)30 ℃恒溫培養(yǎng)。待上述培養(yǎng)皿長出菌落，挑取至添加300 μg/mL潮霉素的 PDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜止培養(yǎng)3~6 d，取菌絲提取基因組DNA。以TH-2基因組DNA為模版，用引物P3、P4進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物用HindⅢ酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳[22?23]。獲得的純合重組菌株命名為TH-2（glaA::pmeA）。

1.2.5asaA基因的敲除 首先根據(jù)同源重組的原理敲除TH-2（glaA::pmeA）中的pyrG基因。將黑曲霉TH-2（glaA::pmeA）與農(nóng)桿菌AGL1（pSZH-ΔpyrG）共培養(yǎng)。篩選培養(yǎng)基為含5-FOA和尿苷的CD培養(yǎng)基，用引物P5、P6進行鑒定，其他方法和步驟同1.2.4。獲得的純合重組菌株命名為TH-2（glaA::pmeAΔpyrG）。

然后根據(jù)同源重組的原理敲除TH-2（glaA::pmeAΔpyrG）中的asaA基因。將黑曲霉TH-2（glaA::pmeAΔpyrG）與農(nóng)桿菌AGL1（pSZHA-pyrG）進行共培養(yǎng)。篩選培養(yǎng)基為CD培養(yǎng)基，用引物P7、P8進行鑒定，其他方法和步驟同1.2.4。獲得的純合重組菌株命名為TH-2（glaA::pmeAΔpyrGasaA::pyrG）。

1.2.6 SDS-PAGE 取新鮮的黑曲霉菌株，接種于100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基（玉米漿20 g/L，豆餅粉30 g/L，葡萄糖100 g/L）中，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)。將3~9 d的發(fā)酵上清液10 μL與10 μL的2×Protein loading buffer混合，沸水浴5~8 min使其中蛋白質(zhì)變性。以Protein marker作為對比，將3~9 d發(fā)酵上清液進行SDS-PAGE檢測，濃縮膠電壓為100 V，分離膠電壓為120 V。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍過夜染色，后用脫色液脫色4~6 h。

1.2.7 果膠甲酯酶酶活的檢測 取3~9 d重組菌株TH-2（glaA::pmeA）或TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）的發(fā)酵上清液測定果膠甲酯酶酶活。酶活定義為：在50 ℃，pH8.5的條件下，1 mL酶液每分鐘催化果膠水解生成甲醛的μmol數(shù)為一個酶活力單位，即1 U。具體檢測方法參照文獻[18]。

1.2.8 果膠甲酯酶酶學(xué)性質(zhì)的檢測 將重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）進行發(fā)酵培養(yǎng)，取第6 d的發(fā)酵上清液，在pH區(qū)間3~8.5范圍內(nèi)，以0.5為梯度逐一進行果膠甲酯酶酶活檢測，對比不同pH條件下，果膠甲酯酶酶活的變化情況。在溫度區(qū)間為20~80 ℃范圍內(nèi)，以10 ℃為梯度逐一進行果膠甲酯酶酶活檢測，對比不同溫度條件下，果膠甲酯酶酶活的變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠甲酯酶pmeA基因的克隆

提取果膠酶生產(chǎn)菌的基因組，用基因特異性引物P1、P2克隆出1267 bp的果膠甲酯酶基因pmeA如圖1所示。將此條帶與pMD-19T連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，提取大腸桿菌質(zhì)粒。將測序得到的質(zhì)粒序列進行Blast比對，結(jié)果表明此序列與Gene ID: 4980618的序列相似性為100%。

2.2 表達載體pSZHG6R-pmeA的構(gòu)建

用基因特異性引物P1、P2克隆出1347 bp的果膠甲酯酶基因pmeA。回收目的基因并與pMD-19T載體相連，轉(zhuǎn)入大腸桿菌受體中，進行大腸桿菌質(zhì)粒的提取，得到質(zhì)粒pMD-pmeA，并用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，可切出大小為1347 bp和2700 bp的片段，將雙酶切回收的pmeA基因片段與pSZHG6R載體連接。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，用XbaⅠ和HindⅢ對其進行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果如圖2所示，1號泳道顯示出2條條帶，分別約15000 bp和4000 bp，證明表達載體pSZHG6RpmeA構(gòu)建成功。

圖 1 pmeA基因擴增結(jié)果Fig.1 Cloning of pmeA by PCR

圖 2 pSZHG6R-pmeA雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of pSZHG6R-pmeA double digestion

2.3 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

表達載體pSZHG6R-pmeA凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的菌落PCR鑒定結(jié)果如圖3所示，1號泳道與質(zhì)粒pSZHG6R-pmeA的陽性對照泳道擴增條帶大小相同，證明表達載體pSZHG6R-pmeA成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。

圖 3 表達載體pSZHG6R-pmeA轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的菌落PCR結(jié)果Fig.3 Colony PCR results of expression vector pSZHG6RpmeA transformed into Agrobacterium tumefaciens

2.4 過表達pmeA純合轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定

以篩選到的黑曲霉菌株基因組DNA為模版，用引物P3、P4進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物用HindⅢ酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4所示，1~3號重組菌株可獲得與陽性對照質(zhì)粒pSZHG6RpmeA相同的條帶。所以1~3號重組菌株均為純合轉(zhuǎn)化子，命名為TH-2（glaA::pmeA）。

圖 4 黑曲霉重組轉(zhuǎn)化子的PCR酶切鑒定結(jié)果Fig.4 Identification results of PCR digestion of recombinant transformants of Aspergillus niger

2.5 重組菌株TH-2（glaA::pmeA）的發(fā)酵與檢測

黑曲霉重組菌株TH-2（glaA::pmeA）發(fā)酵液上清SDS-PAGE結(jié)果如圖5所示，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1%的硫酸銨后，SDS-PAGE結(jié)果如圖6所示。由圖5可知，52 kDa的α-淀粉酶條帶和60 kDa的酸穩(wěn)定的α-淀粉酶條帶為重組菌株的背景蛋白，但在45 kDa處增加了一條明顯的蛋白條帶，與預(yù)測的PmeA分子量34 kDa不符。NetNGlyc 1.0 Server分析結(jié)果表明，在PmeA中有4個潛在的N糖基化位點，推斷是N糖基化修飾增大了PmeA的分子量。發(fā)酵上清液酶活檢測結(jié)果如圖7所示，重組菌株發(fā)酵第9 d酶活達到467.77 U/mL。

圖 5 基本發(fā)酵培養(yǎng)基重組菌株TH-2（glaA::pmeA）SDS-PAGE檢測結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE detection results of recombinant strain TH-2（glaA::pmeA）in basic fermentation medium

由圖5可知，加入硫酸銨的TH-2（glaA::pmeA）發(fā)酵樣本α-淀粉酶條帶逐漸消失。由圖7可知，加入硫酸銨后酶活與對照樣本相比略有提升，其發(fā)酵第8 d酶活最高，達到491.44 U/mL。

圖 6 添加硫酸銨發(fā)酵培養(yǎng)基重組菌株TH-2（glaA::pmeA）SDS-PAGE檢測結(jié)果Fig.6 SDS-PAGE detection results of recombinant strain TH-2（glaA::pmeA）in fermentation medium with ammonium sulfate

圖 7 重組菌株TH-2（glaA::pmeA）的酶活檢測結(jié)果Fig.7 Enzyme activity test results of recombinant strain TH-2（glaA::pmeA）

2.6 重組菌株TH-2（glaA::pmeA）中pyrG基因的敲除

將含敲除原位pyrG基因載體的農(nóng)桿菌AGL1（pSZH-ΔpyrG）與黑曲霉工程菌TH-2（glaA::pmeA）進行共培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA進行PCR擴增和HindIII酶切鑒定，結(jié)果如圖8所示。1~10號樣本出現(xiàn)400 bp左右條帶，與陰性對照條帶相同，為未轉(zhuǎn)化的出發(fā)菌株TH-2（glaA::pmeA）。11、12、13號樣本與陽性對照質(zhì)粒pSZH-ΔpyrG的電泳條帶相同，均未出現(xiàn)TH-2菌株中的400 bp條帶，證明為敲除pyrG基因的純合轉(zhuǎn)化子，命名為TH-2（glaA::pmeAΔpyrG）。

圖 8 敲除pyrG基因的重組轉(zhuǎn)化子PCR鑒定結(jié)果Fig.8 PCR identification results of recombinant transformants knocked out of pyrG gene

2.7 重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrG）中asaA基因的敲除

使用本實驗室已構(gòu)建好的敲除asaA基因的農(nóng)桿菌AGL1（pSZHA-pyrG）與黑曲霉工程菌TH-2（glaA::pmeAΔpyrG）進行共培養(yǎng)。提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA進行PCR擴增和HindIII酶切鑒定。結(jié)果如圖9所示，1~8號重組菌株與陽性對照質(zhì)粒pSZHApyrG的電泳條帶相同，證明為敲除asaA基因的純合轉(zhuǎn)化子，命名為TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）。

圖 9 敲除asaA基因的重組轉(zhuǎn)化子PCR酶切鑒定結(jié)果（HindIII）Fig.9 Identification results of PCR digestion of recombinant transformants knocked out asaA gene（HindIII）

2.8 重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）的發(fā)酵與檢測

將上述重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）在添加1%硫酸銨的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，并進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖10所示。在發(fā)酵第6 d后可以得到一條明顯的果膠甲酯酶蛋白條帶，重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasAA）不再分泌60 kDa的酸穩(wěn)定α-淀粉酶，同時通過加入硫酸銨降解了其分泌的52 kDa的α-淀粉酶背景蛋白。

圖 10 重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）SDS-PAGE檢測結(jié)果Fig.10 Recombinant strain TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）SDS-PAGE test results

取1號純合重組菌株3~8 d上清發(fā)酵液進行酶活測定，結(jié)果如圖11所示，第8 d酶活最高，可達255.40 U/mL，可以表明1號純合重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）分泌的果膠甲酯酶具有較高酶活。

圖 11 重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）的酶活檢測結(jié)果Fig.11 Enzyme activity test results of recombinant strain TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）

2.9 重組果膠甲酯酶的酶學(xué)性質(zhì)測定

取純合重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）發(fā)酵第8 d上清液。對其在不同溫度條件下的酶活進行測定，以50 ℃時的酶活為計算標準，結(jié)果如圖12所示，在50 ℃時果膠甲酯酶活性到達峰值，隨后逐漸回落。其中作用溫度為50 ℃時的酶活為263.85 U/mL，作用溫度為80 ℃時的酶活仍能達到191.24 U/mL，比在常溫20 ℃條件下的酶活性還要高。可以得出結(jié)論，純合重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）分泌的果膠甲酯酶的最適作用溫度為50 ℃，并具有較好的耐熱性，在80 ℃高溫條件下仍能維持其酶活性的70%以上。

圖 12 重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）不同溫度的酶活檢測結(jié)果Fig.12 Recombinant strain TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）enzyme activity test results at different temperatures

取純合重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）分泌的第6 d發(fā)酵上清液。對其在不同pH條件下的酶活進行測定，以pH為8.5時酶活為計算標準，結(jié)果如圖13所示，其中作用pH為4時的酶活最高，最高酶活為397.50 U/mL，為pH為8.5時酶活的195%。隨后酶活隨pH增加呈逐漸下降趨勢。可以得出結(jié)論，純合重組菌株TH-2（glaA::PmeAΔpyrGΔasaA）分泌的果膠甲酯酶的最佳pH作用范圍是3.0~5.0之間，最適作用pH為4.0。

圖 13 重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）不同pH的酶活檢測結(jié)果Fig.13 Recombinant strain TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）enzyme activity test results at different pH

3 討論與結(jié)論

本實驗成功構(gòu)建果膠甲酯酶的超量表達載體，并將其轉(zhuǎn)入受體菌TH-2中，獲得純合重組菌株TH-2（glaA::pmeA）。在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入硫酸銨，可以有效消除背景蛋白中的α-淀粉酶。可能因為硫酸銨被菌體利用后，使得發(fā)酵培養(yǎng)基pH下降[24?26]，而菌體在發(fā)酵后期也會分泌酸性物質(zhì)，最終導(dǎo)致發(fā)酵后期培養(yǎng)基pH下降幅度更大，激活了胞外的酸性蛋白酶活性，使α-淀粉酶被分解[27?28]，趙波等[29]為控制酵母高密度發(fā)酵過程中pH的變化，在發(fā)酵液中添加硫酸銨取得成效。但是在此條件下，背景蛋白中的酸穩(wěn)定α-淀粉酶未被分解。進一步敲除了酸穩(wěn)定α-淀粉酶基因獲得純合重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA），通過發(fā)酵時加入硫酸銨，獲得純度較高的果膠甲酯酶[30?31]。但測得其最高發(fā)酵酶活為255.40 U/mL，低于同樣條件下的黑曲霉工程菌TH-2（glaA::pmeA）的酶活491.44 U/mL，可能是asAA基因或pyrG基因的敲除對菌體的生長和代謝產(chǎn)生了不利影響，其原因還有待于進一步研究。

重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）分泌的果膠甲酯酶在50 ℃條件下酶活性最高，最高酶活達263.85 U/mL；并且在80 ℃的高溫條件下，仍能保持酶活性的70%以上。其最適作用的pH范圍是3.0~5.0，最佳作用pH為4.0，在pH4.0時，最高酶活達397.50 U/mL。所以，純合重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）分泌的果膠甲酯酶在酸性條件下酶促效率更高；此外，在pH為7.0時，其酶活性為最適作用pH時的60%左右。表明用本研究構(gòu)建的工程菌生產(chǎn)的果膠甲酯酶具有較寬的作用溫度和pH范圍，具有很好的應(yīng)用前景。