藍靛果中可降解有機酸的酵母菌株篩選及鑒定

盧思言，曾祥玉，王鑫源，苗曦文，文連奎，賀 陽

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春 130118）

藍靛果（Lonicera edulis）為忍冬科、忍冬屬植物，又名藍靛果忍冬，俗稱羊奶子或山茄子，在長白山區有分布。藍靛果富含豐富的花青素、有機酸和礦物質、維生素等營養成分，為藥食兩用植物，除提取花青素外，目前多加工果汁、果酒、果醬等產品。因藍靛果含有較高的有機酸，影響果酒等產品口感[1?3]，篩選具有降酸作用的微生物十分必要。

果酒降酸方法主要有物理降酸法、化學降酸法及生物降酸法[4?7]，其中生物降酸是通過微生物發酵來分解有機酸以達到降酸目的，對果酒質量和果酒穩定性影響最小，同時還能增加風味，是果酒降酸研究的熱點[8]。目前生物降酸主要是蘋果酸-乳酸發酵降酸，粟酒裂殖酵母發酵降酸以及通過基因重組技術構建新型酵母菌株進行降酸[9?11]。酵母菌降酸的原理是把有機酸轉化為酒精和CO2而達到降酸的目的[12]。郝愛玲等[13]選取篩選自酒莊的菌株東方伊薩酵母M130，降解獼猴桃中的檸檬酸，降酸率達18.12%，且發酵結束后酒體澄清、透明，香氣濃郁。胡小露[14]篩選獲得的鎖擲酵母屬酵母菌可將檸檬酸含量由10.23降至4.66 g/L，同時可使藍莓酒中檸檬酸含量由1.14降至0.59 g/L，且總糖、酒精度、花青素幾乎不變。黃鷺強[15]通過對粟酒裂殖酵母蘋果酸基因克隆，構建整合型質粒并在產朊假絲酵母中進行表達，使獲得的重組酵母菌株CU-6具有降解蘋果酸的能力，降酸率達59.56%。楊華等[16]篩選出一株對紅豆越橘果酒具有明顯降酸效果的二孢接合酵母BY-9，該降酸菌株可以使紅豆越橘果酒的總酸含量下降12.26%，試驗結果表明二孢接合酵母具有良好的降酸能力，同時對酒精的耐受體積分數為20%，對SO2耐受質量濃度為300 mg/L。

目前，能夠降解多種有機酸的菌株研究較少，本文首次從長白山藍靛果中篩選到能夠同時降解蘋果酸、檸檬酸、酒石酸的菌株，利用26S rDNA序列分析及生理生化試驗對降酸菌株進行鑒定，研究其對葡萄糖、SO2及酒精的耐受性，降低藍靛果等長白山野生漿果中有機酸含量，從而為開發果酒產品及菌株后續的實際應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍靛果 2019年6月采于吉林省撫松縣，采摘后用冰袋保存運回吉林農業大學農產品加工及貯藏工程實驗室備用；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基（Yeast Peptone Dextrose Agar Medium）、YPD液體培養基（YPD Broth） 青島海博生物科技有限公司；酒石酸、蘋果酸、檸檬酸 分析純，北京化工廠；L-酒石酸、蘋果酸、檸檬酸標準品（色譜純） 上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純） 賽默飛世爾有限公司；DNA膠回收試劑盒、真菌基因組DNA抽提試劑盒 上海生工生物工程股份有限公司；常規藥品試劑均為國產分析純或優級純。

HZQ-F160生化振蕩培養箱 上海博遠實業有限公司醫療設備廠；立式壓力蒸汽滅菌鍋BXM-30R

上海博訊實業有限公司醫療設備廠；低速離心機LD5-2B 北京雷勃爾離心機有限公司；生物顯微鏡LEICA DM1000、Verity 96well 型PCR儀 美國ABI公司；FR-980A型凝膠成像儀 上海復日科技有限公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠；1200 Series（G1314B VWD)高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；Lambda365紫外分光光度計PerkinElmer公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株分離純化 將藍靛果破碎研磨成果漿，用接種環挑取果漿在平板劃線，在30 ℃生化培養箱中培養72 h，繼續挑取酵母菌單菌落進行純化培養，相同條件下繼續培養72 h，重復平板畫線純化培養[17?18]；配制5 g YPD液體培養基溶于100 mL蒸餾水中，滅菌后選取長勢優良的酵母菌單菌落放入液體培養基中培養，在振蕩培養箱中以30 ℃，150 r/min條件下培養72 h，最后進行甘油保存并命名[19]。

1.2.2 優勢降酸菌株篩選及降酸進程變化 分別配制質量濃度為12 g/L的蘋果酸、檸檬酸、酒石酸酸液。由于YPD培養基中有含酸物質，故最終有機酸質量濃度分別為13.33、12.53和13.04 g/L。將純化優良的菌株分別接種到有機酸溶液當中，在振蕩培養箱中以30 ℃，150 r/min條件下培養5 d[20]，按照GB 5009.157-2016采用酸堿滴定法，每天測定有機酸總酸含量，重復3次取平均值，以最終降酸率為指標篩選出降酸效果較好的優勢菌株。根據優勢降酸菌株發酵5 d內有機酸含量變化，對降酸效果最優的菌株進行降酸效果分析。

式中，A0為未加菌液的有機酸質量濃度；A1為加入菌液以后的有機酸質量濃度。

1.2.3 優勢菌株降解藍靛果汁中有機酸試驗 采用高效液相色譜法測定藍靛果樣品中蘋果酸、檸檬酸、酒石酸含量，與經過菌株B5按1.2.2方法降酸5 d后的藍靛果樣品對比觀察降酸效果，與標準品對照有機酸種類，按峰面積和回歸方程計算降酸率[21]。

高效液相色譜測定條件：色譜柱Agilent ZORBAX Extend-C18（250 mm×4.6 mm），流動相：0.1%磷酸溶液-甲醇，體積比為97.5:2.5，等度洗脫10 min，然后用較短的時間梯度讓甲醇相達到100%并平衡5 min，再將流動相調整為0.1%磷酸溶液-甲醇體積比為97.5:2.5，平衡5 min。流速為0.5 mL/min，進樣量為20 μL，柱溫為40 ℃，檢測波長為210 nm。

標準曲線：分別用超純水溶解配制不同濃度的L-酒石酸、蘋果酸、檸檬酸混合標準溶液，經0.22 μm濾膜過濾后進行HPLC測定，得到有機酸質量濃度（x）和峰面積（y）的標準曲線，回歸方程及相關系數[21]。

樣品處理：降酸前后的藍靛果樣品分別離心（4000 r/min，15 min），吸取上清液于容量瓶中，用超純水定容，稀釋為適合濃度。用 0.22 μm 濾膜過濾后注入高效液相色譜儀中測定[22]。

1.2.4 優勢降酸菌株鑒定 菌株形態學鑒定：進行平板培養，挑取菌落進行染色鏡檢，觀察菌落的生長狀況及形態特征。將酵母菌菌液稀釋涂布于酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基上，30 ℃ 培養72 h，觀察其菌落形態；挑取單菌落于載玻片，經美藍染液染色后，用生物顯微鏡觀察其菌株生長狀況及細胞形態特征[23?24]。

菌株生理生化鑒定：參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》進行降酸菌株的糖發酵、同化碳源、同化氮源試驗等生理生化試驗，30 ℃有氧條件下培養24 h[25]。

分子生物學鑒定：取篩選獲得降酸效果良好的菌體溶于50 μL TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR（Code No.D304）中變性后離心取上清作為模板（Template DNA），反應條件為80 ℃，15 min。

使用2×TransTaq?High Fidelity（HiFi）PCR Super Mix I（TransGen Biotech，Code No：AS131），進行PCR擴增目的片段。陰性對照使用3 μL的 26S-free H2O替代模板DNA；陽性對照使用3 μL的某已知菌株26S rDNA替代模板DNA。

PCR反應體系為：Template DNA 3 μL，Forward primer（10 pmol/μL）1 μL，Reverse primer（10 pmol/μL）1 μL，2×TransTaq? HiFi PCR SuperMix I 25 μL，16Sfree H2O 20 μL，Total 50 μL。

PCR擴增條件為：94 ℃ 預變性5 min；95 ℃10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 1.5 min，循環35次；72 ℃延伸10 min。

26S rDNA測序：以NL1和NL4為引物，上游引物NL1：5' -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAA G-3'；下游引物NL4：5' -GGTCCGTGTTTCAAGA CGG-3'。

將上述測序結果輸入Genebank中，利用BLAST功能組件將測得的基因序列與Genebank數據庫中26S rDNA 序列進行同源性比較。選取BLAST結果中得分較高的菌的26S rDNA序列，使用MEGA 5.2.1軟件根據Neighbor-Joining進行系統進化樹分析[26]。

1.3 降酸菌株耐受性測定

在果酒發酵過程中會加入二氧化硫殺菌，發酵底物還原糖及其他成分還會產生滲透壓，發酵產物為酒精，故需測定菌株的耐受性。

1.3.1 葡萄糖耐受性的測定 將降酸酵母菌株以體積分數2%的接種量接種到50、100、150、200、250 g/L的液體培養基中，控制溫度30 ℃，轉速150 r/min條件下培養24 h，以液體培養基作為空白對照，分別在600 nm處測定酵母菌懸濁液OD值，平行重復3次。根據600 nm處OD 值確定降酸酵母菌株的葡萄糖耐受性[27]，參照國標GB4789-17測定菌落總數。

1.3.2 酒精耐受性的測定 將降酸酵母菌株以體積分數2%的接種量接種到酒精度為6%vol、9%vol、12%vol、15%vol、18%vol 的YPD液體培養基中，控制溫度30 ℃，轉速150 r/min條件下培養24 h，以YPD液體培養基作為空白對照，分別在600 nm處測定酵母菌懸濁液OD值，平行重復3次。依據600 nm處OD值確定降酸酵母菌株的酒精耐受性[28]，參照國標GB/T 4789.17-2003測定菌落總數。

1.3.3 SO2耐受性的測定 將降酸酵母菌株以體積分數2%接種到100、200、300、400、500 mg/L的SO2液體培養基中，控制溫度30 ℃，轉速150 r/min條件下培養24 h，以SO2液體培養基作為空白對照，分別在600 nm處測定酵母菌懸濁液OD值，平行重復3次。根據600 nm處OD值確定降酸酵母菌株的SO2耐受性[29]，參照國標GB/T 4789.17-2003測定菌落總數。

1.4 數據處理

試驗分別均進行三次重復，結果以平均值±SD表示。數據采用Excel、Origin 8.5、GraphPad Prism6、SPSS24進行處理分析及制圖。

2 結果與分析

2.1 優勢降酸菌株篩選及降酸效果分析

2.1.1 優勢降酸菌株篩選 將分離出的酵母菌株對蘋果酸、檸檬酸、酒石酸三種有機酸進行降酸率測定，結果如圖1。由圖1可見，共篩選出5株酵母菌株，分別命名B1、B2、B3、B4、B5，其中對三種主要有機酸降解能力分析可知，菌株B1降酸率為16.95%±0.36%、1.13%±0.23%、1.87%±0.40%；菌株B2降酸率為2.93%±0.58%、?0.29%±0.71%、12.09%±0.69%；菌株B3降酸率為?1.74%±0.42%、3.12%±0.38%、?0.65%±0.61%；菌株B4降酸率為12.18%±0.72%、7.51%±0.27%、0.66%±0.25%；菌株B5的降酸率為42.60%±0.85%、18.28%±0.80%、13.09%±0.61%；其中菌株B5對于蘋果酸降酸率最高為42.60%±0.85%，降解蘋果酸效果最好，同時對酒石酸和檸檬酸也具有降酸效果，故選取菌株B5為最佳降酸菌株。

圖1 不同菌株對蘋果酸、檸檬酸、酒石酸的降酸率Fig.1 Acid reducing rates of malic acid, citric acid and tartaric acid by different strains

2.1.2 優勢菌株B5降酸效果分析 經篩選獲得的優勢降酸菌株B5在液體培養基中培養5 d的含酸量變化，結果如圖2。由圖2可得，三種主要有機酸中蘋果酸含量由13.33±0.13 g/L下降到7.65±0.09 g/L；檸檬酸含量由12.53±0.17 g/L下降到10.24±0.10 g/L；酒石酸含量由13.04±0.06 g/L下降到11.33±0.09 g/L；在發酵5 d過程中蘋果酸、檸檬酸、酒石酸質量濃度均呈持續下降趨勢，其中發酵第1 d三種有機酸質量濃度均無明顯變化，在3~4 d過程中蘋果酸質量濃度下降最多，降酸效果最明顯。T檢驗得到降酸前后含酸量差異極顯著（P<0.01）。趙玉平等[30]采用畢赤酵母對山楂汁中的有機酸進行降解，結果發現該酵母菌株可以降解檸檬酸和蘋果酸，對其他有機酸無明顯降酸能力，其中檸檬酸降解速度在0~72 h階段與時間呈線性關系，蘋果酸降解則發生在48~72 h。

圖2 不同時間菌株B5對蘋果酸、檸檬酸、酒石酸的降酸率Fig.2 Acid reducing rate of strain B5 on malic acid, citric acid and tartaric acid at different time

2.2 優勢菌株降解藍靛果汁中有機酸結果

蘋果酸、檸檬酸、酒石酸三種有機酸混合標準溶液，藍靛果樣品以及加入菌株B5降酸后的藍靛果汁樣品有機酸HPLC色譜圖如圖3（a）~圖3（c） 所示。

由圖3（a）可知有機酸混合標準溶液分離良好，且與圖3（b）~圖3（c）的三種主要有機酸出峰時間幾乎對應。圖3（b）為藍靛果樣品圖，其中蘋果酸含量最高，檸檬酸和酒石酸其次。與加入降酸菌株B5后的藍靛果樣品圖3（c）相比，三種有機酸峰面積均有不同程度減小，其中蘋果酸最為明顯，可知酵母菌株B5對藍靛果中蘋果酸的降解效果最好，根據回歸方程得降酸率為36.24%，同酸堿滴定法測定的降酸趨勢一致。

圖3 菌株B5對藍靛果果汁中有機酸的降解結果Fig.3 Degradation of organic acids in Lonicera edulis juice by strain B5

2.3 優勢降酸菌株鑒定

2.3.1 菌株形態學鑒定結果 將菌株B5置酵母菌固體培養基中，在30 ℃ 條件下培養5 d后進行形態觀察。用肉眼觀察可發現菌株B5菌落為乳白色，球形，表面光滑，質地均勻粘稠，中間略有凸起，邊緣整齊。如圖4（a）用生物顯微鏡觀察細胞呈橢圓形，子囊內含有1~4枚光滑的橢圓形子囊孢子。根據初步觀察可得菌株B5為酵母菌株（圖4（b））。

圖4 菌株B5形態學鑒定圖Fig.4 Morphological identification diagram of strain B5

2.3.2 生理生化鑒定結果與分析 對菌株B5進行酵母菌生理生化試驗，結果見表1。由表1可知，菌株B5能利用葡萄糖發酵，而不能利用麥芽糖、蔗糖等其他糖源；菌株B5能同化的碳源有丙三醇，不能同化纖維二糖、菊糖等其他碳源；菌株B5能同化的氮源有硫酸銨，不能同化的氮源有硝酸鹽。

表1 生理生化試驗結果Table 1 Results of physiological and biochemical tests

2.3.3 分子生物學鑒定

2.3.3.1 菌株B5 PCR擴增反應 對純化后的酵母菌株B5的基因組DNA進行PCR擴增，然后進行瓊脂糖凝膠電泳分析（圖5），在紫外燈照射下的結果可知菌株B5的電泳條帶為592 bp。

圖5 PCR產物電泳圖Fig.5 Electrophoresis of PCR products

2.3.3.2 菌株B5系統進化樹的建立 將測序結果輸入Genebank中，利用BLAST功能組件將測得的基因序列與Genebank數據庫中26S rDNA 序列進行同源性比較。選取BLAST結果中得分較高的菌的26S rDNA序列，使用MEGA5.2.1軟件根據Neighbor-Joining進行系統進化樹構建分析，結果如圖6。從系統發育樹可以看出菌株B5與接合酵母屬（Zygosaccharomyces）遺傳距離最近，同源性最好，結合菌株B5的形態學特征及生理生化試驗可以判斷出菌株B5為二孢接合酵母（Zygosaccharomyces bisporus）。

圖6 菌株B5系統發育進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain B5

2.4 優勢降酸菌株耐受性測定

2.4.1 葡萄糖耐受性的測定 菌株B5的葡萄糖耐受性能結果如圖7所示。如圖7所示，隨著葡萄糖濃度的增長，菌體OD值呈先下降后穩定的趨勢，菌株在培養基中長勢越來越弱，但在250 g/L濃度的高糖濃度下依然能夠存活，吸光度值為0.27±0.04，菌落數為5.10×104CFU/mL。

圖7 菌株B5葡萄糖耐受性能Fig.7 Glucose tolerance of strain B5

2.4.2 SO2耐受性的測定 菌株B5的SO2耐受性能結果如圖8所示。如圖8所示，隨著SO2濃度的增加，OD值呈逐漸下降趨勢，菌株在培養基中長勢越來越弱，菌株B5在400 mg/L二氧化硫濃度下的吸光度值為0.14±0.06，雖然長勢微弱但依然能夠存活，菌落數為3.30×104CFU/mL；但在500 mg/L SO2濃度下的吸光度值為0.01±0.05，降酸酵母菌株幾乎不能存活。

圖8 菌株B5 SO2 耐受性能Fig.8 SO2 tolerance of strain B5

2.4.3 酒精耐受性的測定 菌株B5的酒精耐受性能結果如圖9所示。如圖9所示，隨著酒精濃度的增加，OD值呈逐漸下降趨勢，菌株在培養基中長勢越來越弱，菌株B5在18%vol酒精度下的吸光度值為1.21±0.03，降酸酵母菌株依然能夠存活，菌落數為1.53×105CFU/mL。

圖9 菌株B5酒精耐受性能Fig.9 Ethanol tolerance of strain B5

3 討論

從藍靛果中篩選出的降酸酵母菌株B5在蘋果酸液體培養基中的降酸率為42.60%±0.85%（13.33±0.13 g/L降為7.65±0.09 g/L），由高效液相色譜顯示藍靛果中蘋果酸含量最高，為藍靛果中的主要有機酸，可通過降解蘋果酸進而降低藍靛果產品總酸。試驗中發現，在菌株B5作用下，藍靛果中蘋果酸降酸率為36.24%，與蘋果酸液體培養基中的降酸效果相比有所降低，檸檬酸和酒石酸也顯示相同趨勢。陳思睿等[31]從紅樹莓土壤中篩選獲得降酸酵母菌株T2可將檸檬酸含量從20 g/L降為7.25 g/L，降酸率可達63.75%；將菌株T2作用于總酸含量為25.16 g/L的紅樹莓果汁中可使果汁總酸含量下降到11.24 g/L，脫酸率為55.32%。由此可見，降酸菌株在實際應用中略低于在培養基中的降酸效果，原因可能是降酸酵母菌株應用的產品中除了含有有機酸外，還含有糖類、蛋白質、單寧、果膠等其他成分，對菌株活性產生影響[32]，此外有機酸的初始含酸量也可能影響菌株的降酸效果。

目前，對有機酸具有降解能力的酵母菌株有多個屬種，常見的有陸生伊薩酵母、畢赤酵母以及釀酒酵母等，其中絕大部分只具有降解單一有機酸的能力。劉延嶺等[33]從獼猴桃果園的土壤中篩選出具有蘋果酸降解能力的釀酒酵母菌株ZJ22、PJ34，畢赤酵母ZG13，對蘋果酸的降解比例分別為28.36%、25.92%和25.68%。本試驗經篩選獲得的酸酵母菌株B5為接合酵母屬中的二孢接合酵母，首次從長白山野生漿果中篩選出對蘋果酸、檸檬酸、酒石酸均具有一定降解能力的酵母菌株，使得后續在野生漿果產品降酸領域應用范圍更加廣泛。

對降酸菌株B5進行耐受性試驗可以看出，降酸菌株對葡萄糖、SO2和酒精均具有一定的耐受性，但是隨著葡萄糖、SO2和酒精濃度的增加，降酸酵母菌株B5的生長也逐漸受到抑制，這將不利于產品開發。為了使降酸酵母菌株能夠更廣泛地應用到野生漿果產品當中，可通過酵母菌工程技術對初篩獲得的原始菌株進行改良，使其獲得較原始菌株更強的耐受性能。Cecilia等[34]使用耐低溫酵母菌株S.eubayanusNPCC 1292作為親本菌株，與釀酒酵母菌株雜交獲得的雜交種H20的葡萄糖耐受范圍從120~250 g/L提高到240~300 g/L。雖然降酸酵母菌株B5對藍靛果展現出優良的降酸能力，但這一特性對其他長白山野生漿果產品是否均具有普遍意義還有待進一步探究。

4 結論

對長白山野生藍靛果果實中的酵母菌進行篩選，得到具有良好降解有機酸效果的酵母菌株B5，經形態學檢驗，生理生化試驗及分子生物學鑒定可知菌株B5為二孢接合酵母（Zygosaccharomyces bisporus），其對蘋果酸、檸檬酸、酒石酸的降酸率分別為42.60%±0.85%、18.28%±0.80%、13.09%±0.61%；其在250 g/L葡萄糖質量濃度、400 mg/L SO2質量濃度和18%vol酒精度下仍能存活，具有在藍靛果果汁、果酒等產品開發中應用的潛力。