發酵冬瓜對感染金黃色葡萄球菌小鼠腸道菌群的調節作用

張旨軒，韓姣姣，鮑 偉，王子言，劉 巖，霍春恒，蘇秀榕,

（1.寧波大學，農產品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室，浙江寧波 315211；2.寧波大學海洋學院，浙江寧波 315832；3.寧波大學食品與藥學學院，浙江寧波 315832）

發酵食品是一種傳統的食物保存方法，據《美國心臟病學院雜志》報道，發酵食品中所含的益生菌有益于心臟健康[1]。有學者指出：發酵食品中的益生菌有利于改變腸道中的微環境，通過調節人的腸道菌群來緩解社會焦慮癥[2]。發酵冬瓜（smelly wax gourd，SWG），又稱“臭冬瓜”，是浙東地區傳統的發酵食品，因其獨特的風味而被稱為開胃菜[3]。冬瓜在發酵過程中產生大量的微生物，其中優勢菌是乳酸菌[4]，它通過分解碳水化合物產生乙醇、脂肪酸和過氧化物降低了腸道的pH，抑制了細菌病原菌的生長[5]。發酵冬瓜還產生可具有調節健康潛力的物質，如維生素B、葉酸等[6]，也合成具有神經遞質和免疫調節功能的氨基酸及其衍生物[7]。冬瓜在發酵中通常產生大量的微生物，這些微生物中有相當大一部分通過人類消化道存活[8]。

腸道菌群是近年來人們最為關注的焦點之一，一個人的身體健康狀況不僅取決于自身的遺傳因素，而且還與人體腸道微生物組成成分密切相關。特定的飲食成分對腸道菌群的組成成分以及小分子代謝產物的形成具有深遠的影響，這些微生物可以直接或間接地通過腸上皮影響機體的代謝機制[9]，當飲食發生變化時，腸道菌群結構也會發生一系列的變化[10]。飲食影響腸道菌群，進而影響宿主的生理功能、免疫應答或生長性能[11]。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種廣泛分布于環境中的革蘭氏陽性球菌，在人和家畜的體表尤其在和外界相通的腔道中檢出率相當高，也是冷藏食品和鹽漬食品重要的致病性微生物，通過分泌豐富的毒力分子阻斷人體免疫反應，使得細菌逃避來自宿主免疫系統的攻擊，造成人類廣泛的疾病，如膿皰病、菌血癥和肺炎等[12]。盡管目前已有相關研究表明，可通過生物學方法制備特異性受體靶向作用于金黃色葡萄球菌毒素，從而達到保護機體的目的，但仍然存在諸多問題。例如，研究人員發現，一種特異的小分子球狀蛋白Centyrins（~10 kDa），能夠靶向金黃色葡萄球菌分泌的殺白細胞素（Leukocidins），從而使宿主免受毒素侵害[13]，但由于金葡菌具有耐藥性強、易變異等特點，使得這種單靶點治療方法失敗率較高。因此，本文嘗試采用發酵冬瓜探究其對金黃色葡萄球菌感染小鼠的緩解作用，實驗用發酵冬瓜和金黃色葡萄球菌對小鼠進行灌胃處理，利用高通量測序技術研究小鼠腸道菌群結構的變化情況，旨在為通過飲食干預治療金黃色葡萄球菌感染性腸道疾病奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

4~5周齡ICR小鼠40只（20±2 g），雌雄各半浙江省實驗動物中心[動物編號：1710300006，許可號：SCXK（浙）2014-0001]；冬瓜鹽胚、自然發酵的鹵水 寧波三臭居公司，按固液1:1（w:v）比例混合，制成勻漿后保存在?80 ℃冰箱；金黃色葡萄球菌寧波大學海洋學院實驗室分離并保存；E.Z.N.A.? Stool DNA Kit試劑盒 廣州飛揚生物工程有限公司。

Nano homogenize machine AH100D型ATS高壓均質機 ATS Engineering公司；7890A/M7-80EI型氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 將選取成熟冬瓜，去皮除瓢，切成6~10 cm大小的塊狀煮至七八分熟，鹽胚浸入臭鹵中，按1:1（w:v）比例混合，常溫密封發酵后，放入高壓均質機中制成勻漿備用。金黃色葡萄球菌，在蛋白胨、牛肉膏培養基中37 ℃搖床過夜培養24 h，稀釋成106CFU/mL懸液備用[14]。

1.2.2 動物實驗 將實驗小鼠按性別隨機分成4組，共8組，每組5只，標記后稱重記錄初始體重。對照組（CT）每日灌胃生理鹽水（20 g/kg/day），冬瓜組（SW）每日灌胃發酵冬瓜混合菌液（20 g/kg/day），其中發酵冬瓜的灌胃量前期做了預實驗，發現對小鼠使用這個劑量能與感染金黃色葡萄球菌抗衡。金葡組（SA）每日灌胃金黃葡萄球菌液100 μL[15]，金葡+冬瓜處理組（SA+SW）每日灌胃金黃葡萄球菌液（10 g/kg/day）和發酵冬瓜（10 g/kg/day），連續給藥4 周。每周測量體重。整個實驗過程，小鼠自由攝食和飲水，控制室內溫度（23±1 ℃）和濕度（55%±10%），循環12 h光照/黑暗（燈光）。小鼠灌胃4周后收集糞便于?80 ℃冰箱備用。

1.2.3 高通量測序

1.2.3.1 模板的制備 將糞便樣品收集后立即置于液氮中冷凍，隨后儲存至?80 ℃冰箱中備用。利用QIAamp DNA Stool Mini提取試劑盒抽提糞便DNA，使用Thermo NanoDrop 2000 UV-Vis測定DNA濃度和純度。

1.2.3.2 16S rDNA測序 基因組樣品用DNA Qubit 2.0進行精確定量后，對16S rRNA可變區（V3+V4）進行PCR擴增，預變性98 ℃ 30 s，35個循環，每個循環包括：變性98 ℃ 10 s，退火54 ℃ 30 s，延伸72 ℃45 s，最后延伸10 min進行擴增[16]。擴增結束后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物并切膠回收，精確定量后上機測序[17]。樣品通過Illumina miseq測序儀進行2×300 bp的雙端測序，并利用生物信息學進行分析。

1.2.4 小鼠糞便短鏈脂肪酸含量測定 糞便干燥后稱取30±1 mg，加入0.8 mL的水，0.2 mL 50%的硫酸，1 mL乙醚提取脂肪酸，并用氣-質聯用儀測定。GC檢測條件：DB-WAX聚乙二醇毛細柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣口溫度設為250 °C，檢測溫度為250 °C。升溫程序。MS檢測條件：離子源溫度為230 °C，監測方式為全掃描，EI電離，掃描的質量范圍為45~450 u，掃描的時間為46 min，溶劑延遲時間為7 min[18]。

1.3 數據處理

利用SPSS20.0軟件，采用單因素方差分析（oneway ANOVA）比較各組間的統計學差異。符合正態分布的數據采用ANOVA和Tukey's post hoc test進行分析，不符合方差分析特征的數據采用Mann-Whitney test。*表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極顯著，P<0.01；***表示極其顯著，P<0.001。

2 結果與分析

2.1 腸道菌群的變化

2.1.1 菌群多樣性 如圖1和圖2所示，發酵冬瓜和金黃色葡萄球菌顯著（P<0.05或P<0.01）提高了雄性小鼠腸道菌群的多樣性和豐富度。而雌性小鼠只有喂食發酵冬瓜后腸道菌群的多樣性和豐度顯著提高(P<0.01）。通過加權主坐標分析（UniFrac PCoA）發現喂食發酵冬瓜、金黃色葡萄球菌、金葡菌和發酵冬瓜的小鼠腸道菌群結構與對照組小鼠的腸道菌群結構存在明顯差異。

圖1 小鼠腸道菌群α-多樣性指數Fig.1 Alpha diversity index of mice gut microbiota

圖2 小鼠腸道菌群的PCoA分析Fig.2 Weighted UniFrac PCoA analysis of mice gut microbiota

2.1.2 菌群的結構組成 SW組與CT組相比，雌性小鼠的厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）相對豐度由61.09%和76.73%下降到48.35%和2.92%，擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度由28.02%增加到46.03%。SA組與CT組相比，雄性小鼠厚壁菌門相對豐度由57.01%上升到80.20%，擬桿菌門和變形菌門的相對豐度由26.78%和14.33%下降到13.21%和3.20%，雌性小鼠變形菌門的相對豐度也下降，從7.67%下降至4.76%。SA+SW組與CT組相比，雄性小鼠厚壁菌門相對豐度由57.01%上升到67.18%，變形菌門的相對豐度由14.33%下降4.84%，雌性小鼠厚壁菌門相對豐度由61.09%下降至44.59%，擬桿菌門相對豐度由28.02%上升到42.06%（圖3）。

圖3 小鼠腸道菌群在門水平上的變化Fig.3 Changes on the phylum level of mice gut microbiota

與CT組比較，雌性小鼠與雄性小鼠的SW組乳酸桿菌屬相對豐度分別從32.51%和44.34%下降到7.56%和6.86%，SA組乳酸桿菌屬也下降至15.68%和11.02%，而SA+SW組乳酸桿菌屬相對豐度回升至25.30%和39.16%。雄性小鼠的梭菌屬、Anaerocolumnasp.和羅斯氏菌屬相對豐度在SW組分別由1.51%、0.96%和0.14%上升至6.34%、4.02%和3.61%，在SA組中分別上升至12.81%、5.34%和4.11%，SA+SW組相比SW組和SA組有下降趨勢。雌性小鼠的梭菌屬與雄性小鼠的變化趨勢一致，SW組與SA組梭菌屬相對豐度分別由3.27%增加到7.60%和3.44%，而SA+SW組中的梭菌屬相對豐度下降到2.92%。此外無論雌性還是雄性小鼠，擬桿菌屬在SW組和SA組下降，而在SA+SW組又趨于上升（圖4）。

圖4 小鼠腸道菌群屬水平的變化趨勢Fig.4 Changes on the gene level of mice gut microbiota

與CT組比較，雄性小鼠SW組的約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）、動物乳桿菌（Lactobacillus animalis）和羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）三種菌相對豐度分別從19.56%、17.59%、6.03%降低至0.79%、4.54%和1.3%，在SA組中分別降低至0.49%、9.21%、1.03%，而這三種菌在SA+SW組中與SA組相比相對豐度升高，其中動物乳桿菌升高至25.31%。與對照組相比，SW組的Muribaculum intestinale豐度從17.24%增加到25.49%，而SA組Muribaculum intestinale豐度從17.24%降至8.33%。Kineothrix alysoides、解糖梭菌（Clostridium saccharolyticum）在SA組相對豐度比其他組高。在雌性小鼠中，與CT組比較，SW組和SA組中的動物乳桿菌分別從21.77%下降至4.07%和16.58%，在SA+SW組中回升至28.53%；SW組、SA組、SA+SW組中Muribaculum intestinale相對豐度分別從11.29%上升至30.91%、29.43%和14.26%（圖5）。

圖5 小鼠腸道菌群在種水平的變化Fig.5 Changes on the species level of mice gut microbiota

2.1.3 LEfSe菌群差異分析 基于小鼠腸道菌群進行了LefSe（LDA Effect Size）差異性分析（LDA Score>3），找到了不同組間在豐度上有明顯差異性的物種（biomarker）。在雄性小鼠中，與CT組相比，SW組厚壁菌門中的Kineothrix alysoides、腸道羅斯拜瑞氏菌（Roseburia intestinalis）和Clostridium oryzae菌明顯增加，在SA組中厚壁菌門中的Faecalicatena orotica、化糖梭狀芽孢桿菌（Clostridium saccharolyticum）和帕氏乳桿菌（Lachnoclostridium pacaense）菌的豐度較高，而在SA+SW組中厚壁菌門中的血尿桿菌（Turicibacter sanguinis）和變形菌門中的脫硫芽孢弧菌（Desulfovibrio desulfuricans）豐度較高（圖6A）；在雌性小鼠中SW組Prevotellamassilia timonensis、Parabacteroides distasonisATCC8503、Parabacteroides merdae、Clostridium polysaccharolyticum的豐度較高，SA組中化糖梭狀芽孢桿菌、Anaerocolum najejuensis和帕氏乳桿菌菌豐度較高，而在SA+SW組中豐度較高的菌種則為血尿桿菌和脫硫芽孢弧菌。與CT相比，雌性小鼠喂食SW組中，Prevotella massiliatimonensis、Parabacteroides distasonisATCC8503、Parabacteroides merdae和Longi baculummuris菌的豐度較高，SA組中只有Prevotella shahii菌豐度較高，而SA+SW組中血尿桿菌和脫硫芽孢弧菌豐度較高（圖6B）。

圖6 小鼠腸道菌群的差異物種LEfSe分析Fig.6 LEfSe analysis of gut microbiome in mice

2.1.4 小鼠腸道中益生菌的變化 根據16S rDNA測序結果選擇豐度最高的五類益生菌，分別為擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、葡萄球菌屬和鏈球菌屬。在雄性的四組小鼠腸道中（圖7A），五類益生菌在CT組中的豐度總占比為51.37%，在SWG組為12.21%，在SA組為13.60%，在SA+SWG組為43.61%。其中乳酸桿菌屬在CT組中為46.57%，在SW組中為7.57%，在SA組為11.09%，在SA+SW組為39.26%，而SA組的擬桿菌屬的豐度要低于其他三組。在雌性小鼠腸道中（圖7B），五種益生菌在CT組中的豐度總占比為46.89%，在SA組中占44.37%，在SWG組中占13.18%，在SA+SW組中占26.47%。其中其中乳酸桿菌屬在CONT組中占37.02%，在SW組中占7.00%，在SA組中占40.40%，在SA+SW組中占20.73%。此外，SA組的擬桿菌屬的豐度要低于其他三組。相比于對照組，SA組中這些益生菌群豐度降低，破壞了腸道菌群平衡，而SA+SW組恢復了部分的腸道益生菌群。

圖7 小鼠腸道中益生菌屬分布Fig.7 Distribution of probiotics in the intestinal tract of mice

2.2 腸道菌群與脂肪酸的相關性

短鏈脂肪酸（SCFAs）是腸道菌群的代謝產物，由糖類和氨基酸發酵產生的主要短鏈脂肪酸是乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸[19]。由圖8A可知，在雄性小鼠中，短鏈脂肪酸的含量與副伯克霍爾德菌（Paraburkholderia fungorum）、Faecalicatena orotica、狄氏副擬桿菌（Parabacteroides distasonis）、Prevotellamassilia timonensis、帕氏乳桿菌的產生量呈顯著性正相關。狄氏副擬桿菌、Muribaculum intestinale、Prevotellamassilia timonensis、沙氏普雷沃氏菌（Prevotella shahii）與丁酸和戊酸的產生量呈顯著性正相關，帕氏乳桿菌與乙酸和丙酸的產生量呈顯著性正相關。幽門螺桿菌（Helicobacter canicola）、Muribaculum instestinale、肝螺桿菌（Helicobacter hepaticus）與短鏈脂肪酸的產生量呈負相關，其中Muribaculum intestinale與丙酸的產生量呈顯著性負相關。雌性小鼠中，短鏈脂肪酸的產生與副細菌桿菌（Parabacteroides merdae）、埃氏擬桿菌（Bacteroides eggerthii）、狄氏副擬桿菌、Terrisporobacter petrolearius、Muribaculum intestinale的產生量呈正相關，且這幾種菌與丁酸和戊酸產生量呈顯著性正相關。木腔厭氧菌（Anaerocolumna xylanovorans）、Paraburkholderia fungorum、Clostridium indolis與丁酸和戊酸產生量呈顯著性負相關（圖8B）。

圖8 小鼠腸道菌群優勢菌種與SCFA指標的相關性分析Fig.8 Correlation analysis between dominant species of intestinal flora and SCFA index in mice

3 討論與結論

發酵冬瓜是以新鮮冬瓜為原料，經過乳酸菌、醋酸菌等混合微生物發酵而成的食品。袁曉陽等[20]利用GC-MS對發酵冬瓜的風味物質進行了檢測，結果發現主要風味物質為丁酸、己酸、戊酸、辛酸、2-甲基丁酸、4-甲基苯酚等，它們主要呈不愉快氣體賦予了發酵冬瓜獨特的風味。在發酵過程中亞硝酸鹽峰值在標準范圍內，因此食用發酵冬瓜不會產生安全隱患，且冬瓜在發酵過程中涉及復雜的微生物系統，其中含有大量益生菌群、氨基酸、維生素和膳食纖維以及許多對人體有益的活性物質，有效平衡人體胃腸道的菌群平衡，可促使人體腸胃中的糖發酵，產生多種不同的有機酸，促進胃蛋白酶的分泌和腸胃蠕動能力。

金黃色葡萄球菌可引起多種感染性疾病，從皮膚感染到多器官功能障礙綜合征[21]、感染性心內膜炎、敗血癥甚至死亡。感染金黃色葡萄球菌的腸道中，內部盲腸壁肌層水腫，伴有炎癥出血情況[22]，金黃色葡萄球菌已成為全球醫院感染的主要病原菌[23]。武英等[24]在多次臨床實驗中，用小分子球蛋白（Centyrins）通過靶向阻斷金黃色葡萄球菌的裂解白細胞活性來抑制金黃色葡萄球菌的感染性，但該方法的缺陷是無法從內部中和金黃色葡萄球菌的毒性。

在本實驗中，感染金黃色葡萄球菌的小鼠腸道菌群無論豐富度還是多樣性都不及健康對照組，且在腸道菌群結構上也與對照組存在較大差異，經發酵冬瓜干預后，小鼠腸道菌群在結構上向對照組靠近。無論雄性小鼠還是雌性小鼠，相比于對照組，灌胃金黃色葡萄球菌組的小鼠腸道中益生菌含量如乳酸桿菌屬和擬桿菌屬顯著下降，而經發酵冬瓜干預后回升。益生菌能調整由各種原因造成的腸道菌群失調，乳酸菌代謝產物中大量的有機酸能降低環境的pH，此時大量的H+通過致病菌的細胞膜，導致細胞質的過酸化，從而無法生長。研究發現，灌胃發酵冬瓜的小鼠腸道中，優勢菌乳酸菌和雙歧桿菌都可以發酵多糖產生乙酸和乳酸等，而擬桿菌還具有產葉酸的能力，其釋放的代謝產物可減少革蘭氏陰性與革蘭氏陽性致病菌的數量[25]，具有抑制病原微生物生長，有抗感染和除毒素的功能。此外，研究還表明，發酵品中的乳酸菌和雙歧桿菌已被廣泛用于人類的保健食品中，這些益生菌具有預防某些心血管類疾病和減輕腸道病原微生物感染等功能[26]。

通過差異性分析發現，在金葡菌感染后的小鼠腸道中Muribaculum intestinale等致病菌富集，Muribaculum intestinale屬于紫單胞菌屬（Porphyromonassp.），革蘭氏陰性無芽孢厭氧菌，在大腸腫瘤和胃癌等胃腸道疾病中檢出增多[27]，而經臭冬瓜干預后數量減少。在發酵冬瓜干預后的小鼠腸道中，厚壁菌門中的腸道羅斯拜瑞氏菌與Kineothrix alysoides菌增加，其為常見的產丁酸菌，為人體腸道內降解膳食纖維木聚糖的關鍵細菌[28]。Kazuyuki等[29]認為產丁酸細菌的減少與代謝和炎癥疾病存在關聯，Nature Microbiology發表的研究表明，給小鼠定殖產丁酸的腸道羅斯拜瑞氏菌，可在富含植物多糖的飲食影響下，降低炎癥標志物、改善動脈粥樣硬化，該作用由細菌代謝物丁酸介導。這些發現說明，通過改變飲食-菌群互作，增加丁酸產生菌的干預方法，或能緩解炎癥。

短鏈脂肪酸能夠參與宿主免疫調節并增強腸道屏障[30]，在維持腸道功能、免疫調節、炎癥以及腫瘤等方面有積極作用[31]，SCFAs中尤其是丁酸能通過影響白細胞黏附分子的表達而起到抗炎的作用[32]，還可通過作用于腸上皮細胞表面的G蛋白偶聯受體將信號傳輸給免疫細胞，從而抑制炎癥產生[33]。本研究發現，經金黃色葡萄球菌感染后，小鼠糞便中SCFAs的含量下降，而經發酵冬瓜干預后SCFAs含量升高，且根據實驗結果可得到，狄氏副擬桿菌、沙氏普雷沃氏菌等與丁酸和戊酸的產生量呈正相關，帕氏乳桿菌與乙酸和丙酸產生量呈顯著性正相關，而Clostridium indolis與丁酸和戊酸產生量呈顯著性負相關，Muribaculum intestinale與丙酸產生量呈顯著性負相關。因此，可推測發酵冬瓜用于金黃色葡萄球菌感染小鼠的飲食干預后，可能會增加SCFAs的合成，進而減輕機體的炎癥反應。

發酵冬瓜飲食干預能夠改善小鼠腸道菌群結構，使感染金黃色葡萄球菌小鼠腸道菌群結構、益生菌群的含量以及短鏈脂肪酸的含量恢復至對照組小鼠的腸道菌群結構狀態，從而有效的緩解金黃色葡萄球菌對小鼠的影響，這些結果表明發酵冬瓜緩解金葡菌感染小鼠的另一種機制可能是通過調節腸道菌群的結構，然后由腸道菌群調節特異性炎癥因子，進而實現對金黃色葡萄球菌的免疫效應。