響應面優化黃精渣不溶性膳食纖維酶法提取工藝及其結構表征

丁政宇，張士凱，何子楊，張啟月，李來成，許方舟，吳 澎

（山東農業大學食品科學與工程學院，山東省高校食品加工技術與質量控制重點實驗室，山東泰安 271018）

膳食纖維（dietary fiber，DF）被營養學家稱為“第七大營養素”，由非淀粉多糖組成，它在小腸中既不被消化也不被吸收，但可以在大腸中完全或部分發酵[1]。根據溶解度，分為不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）和水溶性膳食纖維（Water-soluble dietary fiber，SDF）[2]。IDF在增強人體飽腹感[3]的同時，能夠吸附腸道內油脂、糖類等有機物，清除腸道毒素，促進胃腸道蠕動，并且對胰島素進行調控[4]，維持血糖穩定，在預防和緩解便秘、糖尿病、結腸癌、肥胖、中風、高血壓等中有重要作用。目前國內外制備膳食纖維的主要方法有熱水提取法、化學法、酶法、酶-化學結合法及生物發酵法等。其中最常用的是化學法，化學法存在易操作、成本低等優點，但化學法往往需要經過酸堿和高熱的處理，得到的IDF有低品質、色澤較差、持水力和膨脹力較原料有所下降等問題[5]。而本文選用的酶法制備膳食纖維則提取工藝簡單，提取得到的IDF具有純度高、提取條件溫和、易控制且無污染的優勢。

黃精（Polygonatum sibiricum）屬于百合科黃精屬草本植物[6]，具有補中益氣、健脾潤肺、益腎強骨之功效，還有延緩衰老、增強免疫功能、調血脂、降血糖、抗腫瘤等多種藥理作用，是藥食兩用植物[7]。近年來對黃精屬植物的功能成分研究報道較多，主要包括甾體皂苷類、多糖類、黃酮類、生物堿類、醌類、植物甾醇、揮發油、氨基酸、微量元素等[8]。目前黃精主要通過蒸煮炮制，獲得黃精提取物，用于中成藥的生產或作為中藥飲片應用于臨床[9]。由于市場對膳食纖維需求的增加以及人們環境保護意識的增強，越來越多的研究傾向于從植物或蔬菜以及其衍生物中提取膳食纖維。提取后的黃精渣一般都做丟棄處理，但這些黃精皮渣中仍含有大量膳食纖維等功能性成分。黃精的價值遠沒有被開發利用，且目前針對黃精渣的研究較少[10]。本研究以黃精渣為原料，進行膳食纖維的提取及工藝優化，并對其結構表征進行研究，以期提高黃精的綜合利用，擴大黃精產業鏈的發展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃精茶渣、黃精皮渣等黃精渣 工業廢棄，干燥24 h，粉碎，過60目篩，儲存于干燥器直至進一步分析；木瓜蛋白酶（10萬U/g）、α-淀粉酶（10000 U/g）南寧龐博生物工程有限公司；玉米油 山東西王食品有限公司；檸檬酸、碳酸氫鈉 國產食品添加劑。

掃描電鏡 ZEISS 公司；VERTEX 70 傅里葉紅外光譜儀 德國 Bruker 公司；FCD-2000恒溫鼓風干燥箱 上?，槴\實驗設備有限公司；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；電子萬用爐天津市泰斯特儀器有限公司；HJ-6多頭磁力加熱攪拌器 國華儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃精渣中不溶性膳食纖維的制備流程

1.2.2 單因素實驗 設定木瓜蛋白酶濃度0.125%，木瓜蛋白酶酶解時間2 h，α-淀粉酶濃度0.3%，α-淀粉酶酶解時間2 h，考察料液比（g/mL）在1:10、1:15、1:20、1:25、1:30時，對HIDF得率的影響。

設定料液比g/mL=1:20，木瓜蛋白酶酶解時間2 h，α-淀粉酶濃度0.3%，α-淀粉酶酶解時間2 h，考察木瓜蛋白酶濃度在0.05%、0.075%、0.1%、0.125%、0.15%時HIDF得率的影響。

設定料液比g/mL=1:20，木瓜蛋白酶濃度0.125%，α-淀粉酶濃度0.3%，α-淀粉酶酶解時間2 h，考察木瓜蛋白酶酶解時間在1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h時HIDF得率的影響。

設定料液比g/mL=1:20，木瓜蛋白酶濃度0.125%，木瓜蛋白酶酶解時間2 h，α-淀粉酶酶解時間2 h，考察α-淀粉酶濃度在0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%時HIDF得率的影響。

設定料液比g/mL=1:20，木瓜蛋白酶濃度0.125%，木瓜蛋白酶酶解時間2 h，α-淀粉酶濃度0.3%，考察α-淀粉酶酶解時間在1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h時HIDF得率的影響。

1.2.3 響應面試驗結果 基于單因素實驗結果，選用五因素三水平響應面分析法，以HIDF得率為響應值進一步優化工藝，因素水平如表1所示。

表1 Box-Behnken中心組合試驗設計因素水平及編碼Table 1 Factor level and coding of Box-Behnken center combination test

1.2.4 不溶性膳食纖維得率的計算

1.2.5 黃精渣中不溶性膳食纖維結構表征

1.2.5.1 掃描電鏡（SEM）分析 樣品放于雙面膠帶上，以3.00 kV的加速電壓于掃描電鏡觀察臺上收集圖像，放大倍數為180倍和800倍。

1.2.5.2 傅里葉紅外光譜（FTIR）分析 1.00 mg樣品放置于樣品臺上。4000~400 cm?1掃描，掃描次數為64次，分辨率為4 cm?1。

1.2.5.3 XRD衍射分析 將樣品放置于樣品臺上。管流：30 mA；管壓：30 kV；E型：Cu；步長：0.02；起始角：5°；終止角：90°；掃描速度：2°/min；掃描模式：連續性掃描。

1.2.6 黃精渣中不溶性膳食纖維功能性質測定

1.2.6.1 持水力測定 準確稱取待測粉末1.00 g，置于50 mL離心管中，加入20 mL蒸餾水，攪拌30 min，室溫下靜置24 h，以轉速5000 r/min離心10 min，棄上清液，稱濕質量[11]。

1.2.6.2 持油力測定 準確稱取待測粉末1.00 g，置于50 mL離心管中，加入10 mL大豆油，攪拌30 min，室溫下靜置24 h，以轉速5000 r/min離心20 min，小心倒去上層油脂，稱得樣品持油后質量[12]。

1.2.6.3 膨脹力測定 準確稱取待測粉末1.00 g，置于25 mL量筒中，先記錄其初始體積，再加入20 mL蒸餾水，振蕩均勻后在室溫下放置24 h，記錄其膨脹后的體積[13]。

1.3 數據處理

響應面數據采用Design-Expert 8.0.5軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

HIDF得率受料液比的影響詳見圖1a。隨料液比增加，HIDF得率先上升后下降，這是由于隨料液比增大，樣品與水接觸面積增大，有利于樣品HIDF溶出，增加HIDF得率；當料液比為1:20時，HIDF得率最大，達到48.60%；當料液比大于1:20 g/mL時，隨料液比增加，HIDF得率逐漸下降，這可能因為黃精渣中IDF含量有限，當IDF在水中擴散達到平衡后，得率不再上升，隨料液比繼續增加，反而可能使其水解，導致得率下降[14]。這與白蘿卜不溶性膳食纖維的提取類似，在提取白蘿卜IDF時，IDF得率隨料液比的增加也呈現先下降的規律[15]。因此，確定料液比1:15、1:20、1:25 g/mL為最佳優化范圍。

HIDF得率受木瓜蛋白酶濃度的影響詳見圖1b。隨木瓜蛋白酶濃度增加，HIDF得率總體呈上升趨勢，這可能是由于木瓜蛋白酶濃度增大，木瓜蛋白酶水解黃精渣中的蛋白質。當木瓜蛋白酶用量在0.125%時，HIDF得率最大，達到49.90%，這是由于木瓜蛋白酶具有高效性，對蛋白質的水解效果最好[15]；當木瓜蛋白酶用量超過0.125%以后，HIDF的得率不變，這是因為黃精渣中蛋白質含量有限，隨木瓜蛋白酶濃度增加，HIDF得率不受影響。因此，確定木瓜蛋白酶濃度0.1%、0.125%、0.15%為最佳優化范圍。

圖1 各因素對HIDF得率影響Fig.1 Influence of various factors on the yield of HIDF

HIDF得率受木瓜蛋白酶酶解時間的影響詳見圖1c。隨著反應時間的延長，HIDF得率逐步提高，2 h時達到最大值47.91%，但在2 h以后呈下降趨勢?？赡苁? h時酶與底物已充分結合，隨時間的延長，HIDF中其他物質分解。因此，確定木瓜蛋白酶酶解時間1.5、2.0、2.5 h為最佳優化范圍。

HIDF得率受α-淀粉酶濃度的影響詳見圖1d。隨α-淀粉酶濃度增加，HIDF得率總體呈上升趨勢，這可能是由于α-淀粉酶濃度增大，α-淀粉酶水解了黃精渣中的淀粉，當α-淀粉酶用量在0.3%時，HIDF得率最大，達到49.14%；此時是由于α-淀粉酶具有高效性，對淀粉的水解效果最好；當α-淀粉酶用量超過0.3%以后，HIDF的得率降低。這是因為α-淀粉酶用量過大，使黃精渣中一些半纖維素溶出，得到的HIDF含量就較少。因此，確定α-淀粉酶濃度0.2%、0.3%、0.4%為最佳優化范圍。

HIDF得率受α-淀粉酶酶解時間的影響詳見圖1e。隨著反應時間的延長，HIDF得率逐步提高，2 h時達到最大值48.70%，2 h以后先下降后不變?？赡苁? h時酶與底物已充分結合，隨時間的延長得率無明顯差異。因此，確定α-淀粉酶酶解時間1.5、2.0、2.5 h為最佳優化范圍。

2.2 響應面優化結果

2.2.1 回歸模型建立與討論 將表2數據用Design-Expert 8.0.5軟件進行二次線性回歸擬合，得到如下回 歸 方 程：Y=52.57?0.44A+1.32B?0.41C?0.21D?0.40E+0.69AB+0.88AC+0.75AD+7.5×10?3AE?1.08BC?0.26BD?0.075BE?0.35CD+0.17CE?0.062DE?2.44A2?1.58B2?3.73C2?2.57D2?4.83E2。由該方程知，二次項A2、B2、C2、D2和E2系數均為負，說明該方程存在最大值。

表2 響應面分析結果Table 2 Results of response surface analysis

從表3方差分析的結果可以得知，模型的F值為25.47，整體模型P<0.0001，說明該模型極顯著，且失擬項P=0.7831>0.05不顯著，R2=0.9532，表明此模型的擬合程度較好，IDF得率可以用該模型進行分析和預測。對該回歸方程系數進行顯著性檢驗可知，影響極顯著的有：B、A2、B2、C2、D2、E2（P<0.01），影響顯著的有：A、C、AC、BC（P<0.05）。由F值得出，影響IDF得率的四個因素的主次順序為B>A>C>E>D，即木瓜蛋白酶濃度>料液比>木瓜蛋白酶酶解時間>α-淀粉酶酶解時間>α-淀粉酶濃度。

表3 響應面試驗方差分析Table 3 Variance analysis of response surface method

2.2.2 交互效應分析 響應曲面（圖2）反映了當料液比、木瓜蛋白酶濃度、木瓜蛋白酶酶解時間、α-淀粉酶濃度、α-淀粉酶酶解時間，5個因素的任意兩個變量取零點水平時，其他2個因素的交互作用對HIDF得率的影響。料液比和木瓜蛋白酶酶解時間對HIDF得率影響的等高線相對密集，表明料液比和木瓜蛋白酶酶解時間對得率影響較大；木瓜蛋白酶酶解時間和木瓜蛋白酶濃度對HIDF含量影響的等高線密集，表明木瓜蛋白酶酶解時間和木瓜蛋白酶濃度對得率影響更顯著。

圖2 各因素交互作用對HIDF得率影響的響應面圖Fig.2 Response surface diagram of the influence of the interaction of various factors on the yield of HIDF

2.2.3 最佳方案確定與驗證 通過對模型結果的分析處理，確定最優工藝條件為：料液比1:19.71 g/mL，木瓜蛋白酶濃度0.13%，木瓜蛋白酶酶解時間1.94 h，α-淀粉酶濃度0.29%，α-淀粉酶酶解時間1.98 h，此條件下HIDF得率52.92%。為了驗證模型分析的準確性，選取料液比1:20 g/mL，木瓜蛋白酶濃度0.13%，木瓜蛋白酶酶解時間1.9 h，α-淀粉酶濃度0.29%，α-淀粉酶酶解時間2.0 h，進行驗證，實驗重復3次取平均值，所得HIDF得率為52.18%，與理論預測值相近，可見該模型具有重現性、可行。

2.3 掃描電鏡（SEM）分析

HIDF的掃描電鏡如圖3所示，當放大倍數為180倍時，HIDF存在較多的纖維束，具有空腔且有一定的螺旋程度。當放大倍數為800倍時，纖維的空間網狀結構十分疏松，孔隙較大，表面有較多的凸起，其表面呈現疏松多孔的結構，這些孔洞造就了其良好的親水性，提升了膳食纖維整體的持水力和結合水力，同時也是膳食纖維具有良好吸附性的原因之一[16]。

圖3 HIDF的掃描電鏡Fig.3 Scanning electron microscopy of HIDF

2.4 傅里葉紅外光譜（FTIR）分析結果

HIDF紅外光譜分析如圖4所示。3400 cm?1處出現較寬的吸收譜帶，此處是由于纖維素和半纖維素O-H伸縮振動產生，主要來源于果膠（半乳糖醛酸）和半纖維素（木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖）[17]。2920和2850 cm?1處出現吸收峰，此處是糖類甲基上C-H的收縮振動吸收峰，是多糖類物質的典型特征[18]。1620和1520 cm?1處出現吸收峰，此波段范圍為芳香環的伸縮振動[19]。1240 cm?1處吸收峰代表木質素和半纖維素中C-O甲氧基的伸縮振動[20]。1030 cm?1處是纖維素和半纖維素C-O、C-C和CO-C的拉伸[21]，符合膳食纖維結構。

圖4 HIDF的紅外光譜圖Fig.4 Infrared scanning polygonatum of IDF

2.5 XRD衍射分析結果

HIDF的X射線衍射譜圖如圖5所示。X-射線衍射圖譜可以反映物質的晶體結構。IDF的核心成分纖維素具有結晶性結構，HIDF在掃描角度2θ=21.42°處出現主衍射峰，在2θ=26.74°和2θ=34.39°出現兩個次衍射峰，都表現出纖維素I型的特征衍射峰[22]，對其親水、親油等物理化學性質都會產生一定影響[23]。

圖5 HIDF的X射線衍射譜圖Fig.5 X-ray diffraction pattern of HIDF

2.6 HIDF功能性質測定

通過實驗分析，膳食纖維的水合作用主要取決于其表面親水基團和結構中的松散空腔。由表4可知，HIDF持水力為（5.99±0.05）g/g，高于豆渣中不溶性膳食纖維（2.83±0.13）g/g[24]、大豆不溶性膳食纖維3.62 g/g[25]。持油力主要表現在膳食纖維對油脂的吸附能力，良好的吸附作用減少了人體腸道對脂肪的吸收，起到一定的減肥功效，HIDF持油力為（3.97±0.04）g/g，高于白蘿卜不溶性膳食纖維2.12 g/g[26]、地瓜渣不溶性膳食纖維0.574 g/g[27]。膨脹力為（4.57±0.05）mL/g，高于麩皮不溶性膳食纖維3.10 mL/g[28]。表現出了良好的理化性質，適合加工成功能性食品。

表4 黃精渣中膳食纖維的功能性質測定Table 4 Determination of functional properties of dietary fiber in Polygonatum sibiricum residue

3 結論

采用單因素和響應面優化酶法提取黃精渣中不溶性膳食纖維，并確定最佳提取工藝為：料液比1:20 g/mL，木瓜蛋白酶濃度0.13%，木瓜蛋白酶酶解時間1.9 h，α-淀粉酶濃度0.29%，α-淀粉酶酶解時間2 h，在此條件下HIDF得率為52.18%；功能實驗結果表明，HIDF的持水力為（5.99±0.05）g/g，持油力為（3.97±0.04）g/g，膨脹力為（4.57±0.05）mL/g，性質良好，在功能強化型食品及保健品開發等方面具有廣闊前景。通過對不溶性膳食纖維的結構進行表征可知，黃精渣中不溶性膳食纖維表現出纖維素I型的特征衍射峰，且具有較多的螺旋狀纖維束和空腔，纖維的空間呈現網狀結構，表面疏松多孔，含有較多的纖維素和半纖維素。響應面優化酶法提取黃精渣中不溶性膳食纖維的工藝、表征及物理性質測定，可為以后黃精不溶性膳食纖維的研發提供理論基礎，為黃精渣開發利用提供參考，有利于黃精的進一步綜合開發利用。