超聲微波協(xié)同制備粗毛纖孔菌多糖及體外降脂作用的研究

趙有偉，李德海

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）

隨著生活質(zhì)量的提高，人們?nèi)粘Ｉ钪袑?duì)高脂、高糖、高能量飲食的攝入增加，導(dǎo)致高血脂癥患病人群數(shù)量增加，高血脂癥已成為世界關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題[1]。預(yù)防與治療高脂血癥的方法有運(yùn)動(dòng)鍛煉、控制飲食和藥物治療等方式，其中藥物治療方式效果雖好，但是有毒副作用[2]。有研究表明天然產(chǎn)物中含有許多降血脂的物質(zhì)，從天然產(chǎn)物中開(kāi)發(fā)降血脂的物質(zhì)成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)[3]。

粗毛纖孔菌Inonotus hispidus（Bull.）Pat.，又名粗毛黃褐孔菌，是一種非常珍貴的藥用真菌[4]。粗毛纖孔菌作為一種藥用真菌，具有抗腫瘤[5]、抑菌[6]、抗氧化[7]、降血脂[8]、提高免疫力[9]等生物活性。目前已經(jīng)從粗毛纖孔菌中分離得到多種具有生物活性的化合物，包括多糖類[10]、三萜類[11]和酚類[12]等。多糖作為粗毛纖孔菌中的主要活性成分，具有提高免疫力、抗腫瘤、抗氧化、降血糖等作用[13?14]。但提取方法對(duì)有效活性成分的提取效果以及活性的影響很大[15]。張倩等[16]研究熱水浸提和超聲微波協(xié)同提取對(duì)枸杞多糖的提取率和抗氧化活性影響，結(jié)果表明超聲微波協(xié)同法得到的枸杞多糖提取率顯著高于熱水浸提法，且超聲微波協(xié)同法得到的多糖對(duì)自由基的清除能力比熱水浸提法更好。蘇平等[17]研究四種不同輔助提取方法對(duì)黃秋葵花多糖的提取率和抗氧化活性的影響，四種方法對(duì)比發(fā)現(xiàn)酶法提取的黃秋葵花多糖提取率最高，四種方法提取的多糖抗氧化活性效果不同，超聲輔助提取的多糖表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性。馬舒?zhèn)サ萚18]研究不同方法對(duì)玄參多糖單糖組分和抗氧化活性的影響，不同方法提取的玄參多糖對(duì)比發(fā)現(xiàn)，酶輔助提取法提取的玄參多糖的純度最高，體外抗氧化活性最強(qiáng)。

超聲微波協(xié)同輔助提取法充分利用了超聲波震動(dòng)的空化作用與微波的高能效應(yīng)和熱效應(yīng)，將超聲微波相結(jié)合，既能縮短提取時(shí)間，又可以提高提取效率，從而實(shí)現(xiàn)高效快速的處理樣品[19]，有學(xué)者采用微波超聲組合提取猴頭菇多糖與熱水提取法、超聲波提取法和微波提取法相比，發(fā)現(xiàn)微波超聲聯(lián)用組合具有節(jié)省時(shí)間和多糖浸出率高等優(yōu)點(diǎn)[20]。因此為提高粗毛纖孔菌多糖的提取率，本文采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究了超聲微波協(xié)同制備粗毛纖孔菌多糖的工藝，并與微波輔助提取法和熱水提取法對(duì)比分析了粗毛纖孔菌多糖提取率及體外膽酸鹽結(jié)合能力，以期為把粗毛纖孔菌多糖開(kāi)發(fā)成為一種降脂功能性食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗毛纖孔菌子實(shí)體 于2020年9月采自東北林業(yè)大學(xué)林場(chǎng)；葡萄糖、濃硫酸、苯酚 國(guó)產(chǎn)分析純；甘氨膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、胃蛋白酶（1:3000）、胰蛋白酶（1:250） 上海源葉生物生物科技有限公司。

Scientz-IIDM型微波光波超聲波萃取儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；722s型紫外分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；GL10048型萬(wàn)分之分析天平 上海佑科儀器儀表有限公司；TDL40BW型臺(tái)式離心機(jī) 上海星科科學(xué)儀器有限公司；HH-4型電熱恒溫水槽 上海力辰儀器科技有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理 將采摘的新鮮粗毛纖孔菌子實(shí)體于烘箱中60 ℃烘干，高速粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩，備用。

1.2.2 超聲微波協(xié)同制備粗毛纖孔菌子實(shí)體多糖工藝

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取一定量的粗毛纖孔菌干粉于三角瓶中，加入一定體積的蒸餾水，充分?jǐn)嚢韬蠓胖梦⒉ü獠ǔ暡ㄝ腿x中，固定實(shí)驗(yàn)參數(shù)料液比1:30 g:mL，超聲時(shí)間30 min，超聲功率200 W，微波時(shí)間30 s，微波功率300 W，分別考察料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g:mL），超聲時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）、超聲功率（100、200、300、400、500 W）、微波時(shí)間（10、20、30、40、50、60 s）、微波功率（100、200、300、400、500、600 W）對(duì)超聲微波輔助提取粗毛纖孔菌多糖提取率的影響，將制備得到的多糖提取液在4000 r/min離心15 min，上清液即為粗毛纖孔菌子實(shí)體多糖溶液，殘?jiān)瓷鲜霾襟E復(fù)提兩次，合并提取液。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/4，冷卻后測(cè)多糖含量。得出五個(gè)單因素對(duì)IHP提取率的影響，最終根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平。

1.2.2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用Design-Expert8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平表見(jiàn)表1。根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，建立數(shù)學(xué)模型，確定IHP的最佳提取條件。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1 Factors, levels and coding for response surface design

1.2.3 不同提取方法對(duì)粗毛纖孔菌多糖提取率的影響將優(yōu)化后的超聲微波輔助法對(duì)IHP的提取率與熱水浸提法和超聲輔助法進(jìn)行對(duì)比。超聲微波輔助提取法：稱取一定量的粗毛纖孔菌干粉于三角瓶中，按料液比1:30加入蒸餾水，充分?jǐn)嚢韬螅糜诜胖梦⒉ü獠ǔ暡ㄝ腿x中，設(shè)定超聲時(shí)間51 min，超聲功率200 W，微波時(shí)間50 s，微波功率500 W進(jìn)行提取，離心取上清液，測(cè)多糖含量。熱水浸提法和超聲輔助法采用預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的工藝條件。熱水浸提法：稱取一定量的粗毛纖孔菌干粉于三角瓶中，按料液比1:30加入蒸餾水，充分?jǐn)嚢韬螅?0 ℃水浴浸提3 h，提取結(jié)束后，離心取上清液，測(cè)多糖含量。超聲輔助法：稱取一定量的粗毛纖孔菌干粉于三角瓶中，按料液比1:30加入蒸餾水，充分?jǐn)嚢韬螅糜诜胖梦⒉ü獠ǔ暡ㄝ腿x中，設(shè)置超聲功率200 W，超聲時(shí)間1 h，提取結(jié)束后，離心取上清液，測(cè)多糖含量。

1.2.4 粗毛纖孔菌多糖含量的測(cè)定

1.2.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 采用苯酚-硫酸法測(cè)定糖含量[21]準(zhǔn)確稱取經(jīng)真空干燥恒重的葡萄糖40 mg，于500 mL容量瓶中定容配制成80 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，取2.0 mL蒸餾水為空白樣，用移液槍依次吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于具塞試管，各管補(bǔ)加蒸餾水至2.0 mL，加入6%苯酚1 mL，98%濃硫酸5 mL，靜置10 min后振蕩混勻，室溫下靜置20 min后，充分反應(yīng)，于490 nm下測(cè)定OD值，以葡萄糖含量（μg/mL）為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的線性回歸方程y=0.0146x+0.3004，R2=0.9931，可以用于計(jì)算多糖含量。

1.2.4.2 多糖含量的測(cè)定 準(zhǔn)確吸取2 mL已提取好的IHP溶液，加入6%苯酚1.0 mL和98%濃硫酸5.0 mL，靜置10 min后振蕩混勻，在室溫下放置20 min，于490 nm下測(cè)定OD值。若測(cè)得樣品多糖濃度不在測(cè)量范圍內(nèi)，應(yīng)當(dāng)稀釋再次測(cè)量。粗毛纖孔菌多糖的提取率為提取液中的多糖與總多糖的比值，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，采用熱水法反復(fù)多次提取確定了粗毛纖孔菌子實(shí)體多糖含量為16.4%。提取率計(jì)算公式為：

式中：C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的粗毛纖孔菌水提液液所含多糖的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為粗毛纖孔菌水提液總體積，mL；N為溶液最終的稀釋倍數(shù)；k為粗毛纖孔菌子實(shí)體粉末的重量，g；m為1 g粗毛纖孔菌子實(shí)體粉末總多糖含量，%。

1.2.5 體外降脂實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 膽酸鹽測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[22]分別取不同濃度的膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（甘氨膽酸鈉0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.3 mmol/L，牛磺膽酸鈉0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mmol/L），2 mL于具塞試管中，向每管標(biāo)準(zhǔn)溶液中依次加入6 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的H2SO4，70 ℃恒溫水浴鍋中水浴20 min，取出后進(jìn)行冰浴5 min，在387 nm處測(cè)定吸光度，分別作兩種膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，牛黃膽酸鈉的回歸方程為y=2.8591x?0.0176，R2=0.9957，可以用于計(jì)算牛磺膽酸鈉含量。甘氨膽酸鈉的回歸方程為y=1.5012x+0.0536，R2=0.9957，可以用于計(jì)算甘氨膽酸鈉含量。

1.2.5.2 粗毛纖孔菌多糖膽酸鹽結(jié)合能力的測(cè)定粗毛纖孔菌多糖提取液以1:3的比例加入95%乙醇，4 ℃醇沉24 h，離心，去除上清液，沉淀即為粗毛纖孔菌粗多糖，將粗多糖用蒸餾水配制成20 mg/mL多糖溶液分別吸取1 mL粗毛纖孔菌粗多糖溶液于100 mL具塞三角瓶中，加入1 mL10 mg/mL胃蛋白酶，3 mL 0.01 mol/L的HCl溶液，在37 ℃恒溫振蕩，模擬胃環(huán)境（pH為1.5）消化1 h；以0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH至6.3，再加入4 mL10 mg/mL胰蛋白酶，模擬腸道環(huán)境進(jìn)行消化1 h，加入4 mL 1 mmol/L膽酸鹽消化1 h，4000 r/min離心20 min，取上清液，比色測(cè)定膽酸鹽含量，平行3次實(shí)驗(yàn)。甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉結(jié)合率按下式計(jì)算。

式中：c1為甘氨膽酸鈉加入量，μmol，c2為甘氨膽酸鈉剩余量，μmol，c3為牛磺膽酸鈉加入量，μmol，c4為牛磺膽酸鈉剩余量，μmol。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析（analysis of variance，ANOVA）單因素方差分析，數(shù)據(jù)以表示，組間做t檢驗(yàn)，P<0.05則表示有顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)IHP提取率的影響 由圖1可知，IHP提取率隨料液比的增加而提高，其中當(dāng)料液比在小于1:30 g:mL時(shí)，IHP提取率隨料液比比例的增加而顯著提高（P<0.05），當(dāng)料液比大于1:30 g:mL時(shí)，IHP提取率增加不顯著（P>0.05）。當(dāng)料液比小于1:30 g:mL時(shí)，由于提取溶劑的量過(guò)少，IHP提取液中多糖處于飽和狀態(tài)，粗毛纖孔菌中的多糖無(wú)法進(jìn)一步溶出，此時(shí)隨著提取溶劑量的增加，多糖不斷溶出，提取率也在增加。但是當(dāng)料液比大于1:30 g:mL時(shí)，粗毛纖孔菌中多糖已經(jīng)大量溶出至提取溶劑中，而提取溶劑中多糖也沒(méi)有達(dá)到飽和狀態(tài)，因此即使增加提取溶劑用量，IHP提取率變化不大[23]，差異性不顯著（P>0.05），所以選取最佳料液比為1:30 g:mL。

圖1 料液比對(duì)IHP提取率的影響Fig.1 Effect of material-to-liquid ratio on the extraction rate of IHP

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)IHP提取率的影響 由圖2可知，IHP的提取率隨超聲波作用時(shí)間的增加而增加，主要是由于超聲波作用時(shí)間增加，粗毛纖孔菌細(xì)胞破裂，多糖不斷溶出，在50 min時(shí)達(dá)到最大值，60 min多糖的提取率略微降低，可能原因是超聲波作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生影響，會(huì)導(dǎo)致多糖降解，影響多糖的生物活性[24?25]。選取最優(yōu)超聲時(shí)間為50 min。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)IHP提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasound time on the extraction rate of IHP

2.1.3 超聲功率對(duì)IHP提取率的影響 由圖3可知，隨著超聲功率的增大，IHP的提取率先增大后減小在200 W處達(dá)到最大值，300 W處有下降趨勢(shì)，但是差異不顯著（P<0.05），300 W之后開(kāi)始降低，可能是在較大的超聲功率下，超聲波的振動(dòng)作用、空化效應(yīng)和粉碎作用過(guò)強(qiáng)，從而導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)受到破壞從而損失，導(dǎo)致多糖的提取率降低[26]。陳宇航等[27]研究超聲微波協(xié)同提取豆渣水溶性多糖發(fā)現(xiàn)，超聲功率超過(guò)300 W，多糖分子在較強(qiáng)的機(jī)械作用下發(fā)生斷裂，從而引起提取率的急劇下降。因此選擇超聲功率為200 W作為最佳超聲功率。

圖3 超聲功率對(duì)IHP提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of IHP

2.1.4 微波功率對(duì)IHP提取率的影響 由圖4可知，隨微波功率的增加，IHP的提取率增加，微波功率為100~300 W時(shí)，多糖的提取率增加顯著（P<0.05），可能是由于微波功率增加，微波作用的強(qiáng)度增大，對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞作用，促進(jìn)多糖的釋放，從而提高多糖提取率[28]。微波功率為300~600 W時(shí)，多糖的提取率有所增加，變化不顯著（P>0.05），趨于平穩(wěn)，主要原因?yàn)樵谖⒉üβ?00 W時(shí)，原料中的多糖已經(jīng)被最大限度提出來(lái)，因此多糖提取率不會(huì)繼續(xù)升高，與最大值基本保持一致。最佳微波功率選取范圍為200~600 W。

圖4 微波功率對(duì)IHP提取率的影響Fig.4 Effect of microwave power on the extraction rate of IHP

2.1.5 微波時(shí)間對(duì)IHP提取率的影響 由圖5可知，IHP的提取率隨微波作用時(shí)間的增加而增加，在微波時(shí)間為50 s時(shí)，提取率達(dá)到最大值，60 s時(shí)多糖的提取率略微下降，可能是由于微波作用的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致多糖發(fā)生熱降解，導(dǎo)致提取率下降[29]。考慮到微波作用時(shí)間為60 s時(shí)，多糖的提取率與50 s時(shí)多糖的提取率相比，差異性不顯著（P>0.05），且微波作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能對(duì)多糖活性有影響，因此選取50 s作為最佳微波時(shí)間。

圖5 微波時(shí)間對(duì)IHP提取率的影響Fig.5 Effect of microwave time on the extraction rate of IHP

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定超聲功率200 W，選取料液比、超聲時(shí)間、微波時(shí)間和微波功率四個(gè)影響因素作為自變量，多糖提取率作為因變量，根據(jù)Box-Behnken的原理，使用Design Expert8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。實(shí)驗(yàn)共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，包括5個(gè)中心點(diǎn)。表2是響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)方案及結(jié)果。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

2.2.2 二次回歸模型擬合及模型分析 通過(guò)29組關(guān)于多糖提取率的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到的二次多元回歸模型為：

對(duì)該回歸方程的分析見(jiàn)表3。由表3可知，模型的F=37.59，P<0.0001，表明該模型達(dá)到極顯著水平，且失擬項(xiàng)P=0.1394>0.05，表明該模型擬合良好，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該模型離散系數(shù)CV=1.87%，RPred2=0.8630，RAdj2=0.9482。在合理范圍內(nèi)，Adeq Precision=24.653，表明可以用來(lái)預(yù)測(cè)超聲微波協(xié)同萃取IHP的提取率。模型中A、C、D、BD、A2、B2、D2對(duì)IHP提取率的影響極顯著（P<0.01），B、BC和C2影響顯著（P<0.05），而交互項(xiàng)AB、AC、AD和CD影響不顯著，表明各因素對(duì)提取率的影響并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。從一次項(xiàng)來(lái)看，根據(jù)方差分析中的F值可判斷各個(gè)因素對(duì)提取率的影響大小為D>A>C>B，即料液比>超聲時(shí)間>微波功率>微波時(shí)間。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)方差分析Table 3 Box-Behnken experiment variance analysis

2.2.3 IHP提取最優(yōu)條件的確定與驗(yàn)證 根據(jù)所建立的二次回歸模型，使用Design-Expert8.06進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化分析，得到超聲波微波協(xié)同提取IHP的最佳工藝條件為：超聲時(shí)間51.45 min，微波時(shí)間50 s，微波功率523.89 W，料液比1:33.21 g:mL，在此條件下多糖的提取率可達(dá)85.92%。對(duì)軟件得到的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行調(diào)整：超聲時(shí)間51 min，微波時(shí)間50 s，微波功率500 W，料液比1:33 g:mL，在此條件下進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得IHP的提取率平均為85.61%±1.32%，與模型的預(yù)測(cè)值較為接近，表明該回歸方程可以很好地反映IHP的提取率。

2.3 提取方法對(duì)IHP制備效果的比較分析

優(yōu)化后的超聲微波協(xié)同提取法與熱水浸提法、超聲輔助法對(duì)粗毛纖孔菌多糖的提取率對(duì)比，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，三種提取方法中，超聲微波輔助法提取率最高，為85.05%，其次是超聲輔助法68.11%，提取率最低的是熱水浸提法62.36%，超聲波微波輔助提取法相對(duì)于超聲波輔助法，提取率增加24.87%，相對(duì)于熱水提取法，提取率增加36.38%。超聲輔助法可以明顯提高IHP的提取率，這主要是由于超聲波的機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)能有效的破碎粗毛纖孔菌的細(xì)胞壁，使得多糖快速溶出，從而提高IHP的提取率[30]。超聲微波輔助法提取率明顯高于超聲輔助提取法，可能是由于超聲波和微波協(xié)同作用，對(duì)粗毛纖孔菌細(xì)胞的破碎作用增加，使多糖的溶出率提高，且超聲微波協(xié)同作用可以使微波的傳熱均勻，彌補(bǔ)超聲波產(chǎn)熱不足的問(wèn)題，從而提高IHP的提取率[31]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲微波輔助提取法可以明顯提高IHP的提取率。

圖6 不同提取方法對(duì)IHP提取率的影響Fig.6 Effect of different extraction methods on the extraction rate of IHP

2.4 提取方法對(duì)IHP體外膽酸鹽結(jié)合的影響

由圖7可知，三種不同方法提取的IHP對(duì)甘氨膽酸鈉均有一定的結(jié)合能力，且隨著質(zhì)量濃度的增加，結(jié)合率也逐漸升高，呈質(zhì)量濃度依賴性。但是三種方法提取的IHP在相同質(zhì)量濃度的條件下對(duì)甘氨膽酸鈉的結(jié)合能力存在顯著差異（P<0.05），可以看出超聲微波輔助提取的IHP的結(jié)合率明顯高于其他兩種方式提取的多糖。當(dāng)質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí)，三種方式提取IHP對(duì)甘氨膽酸鈉的結(jié)合率均達(dá)到最大值，分別是30.93%、27.32%和23.16%，其中超聲微波輔助法IHP結(jié)合率最高，其次是超聲輔助提取，熱水浸提得到的多糖結(jié)合率最低。說(shuō)明超聲微波輔助法提取的IHP與甘氨膽酸鈉結(jié)合能力強(qiáng)，推測(cè)超聲微波輔助法提取的IHP降血脂效果更好。

圖7 三種不同方式提取多糖結(jié)合甘氨膽酸鈉能力Fig.7 Binding ability of polysaccharides extracted in three different ways to sodium glycocholate

由圖8可知，三種不同方式提取的IHP均能結(jié)合牛磺膽酸鈉，牛磺膽酸鈉的結(jié)合率隨IHP的質(zhì)量濃度的增加而增加，呈一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。從圖中可以看出，超聲微波輔助提取IHP對(duì)牛磺膽酸鈉的結(jié)合率高于其他兩種提取方式，三種方式提取多糖質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí)，對(duì)牛磺膽酸鈉的結(jié)合率達(dá)到最高，分別是超聲微波輔助提取32.13%、超聲波輔助28.05%、熱水浸提24.82%。

圖8 三種不同方式提取多糖結(jié)合牛黃膽酸鈉能力Fig.8 Binding ability of polysaccharides extracted in three different ways to sodium taurocholate

三種提取方式制備的粗毛纖孔菌多糖對(duì)兩種膽酸鹽的結(jié)合能力顯示，超聲波微波輔助提取的多糖對(duì)牛磺膽酸鈉和甘氨膽酸鈉的結(jié)合率均高于其余兩種方式，其次是超聲波輔助提取，而熱水浸提的粗毛纖孔菌多糖對(duì)兩種膽酸鹽的結(jié)合能力最低，這可能是因?yàn)椋暡ㄎ⒉ㄝo助提取法中，由于超聲波和微波的作用使得粗毛纖孔菌多糖的官能團(tuán)暴露出來(lái)，從而提高粗毛纖孔菌多糖對(duì)兩種膽酸鹽的結(jié)合量，使得粗毛纖孔菌多糖的降脂效果增加[32]。三種方式提取的IHP對(duì)牛磺膽酸鈉的結(jié)合能力均強(qiáng)于甘氨膽酸鈉，這可能是因?yàn)榕；悄懰徕c側(cè)鏈末端的磺酸基的極性更大比甘氨膽酸鈉側(cè)鏈末端的羧基解離性更強(qiáng)[33]，更加易于與IHP結(jié)合。

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面對(duì)粗毛纖孔菌子實(shí)體多糖超聲微波協(xié)同提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)軟件得到的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行調(diào)整：超聲時(shí)間51 min，微波時(shí)間50 s，微波功率500 W，料液比1:33 g:mL，在此條件下IHP的提取率為85.61%，與模型的預(yù)測(cè)值較為接近。與熱水浸提法和超聲輔助法相比，提取率分別增加了24.87%、36.83%。體外膽酸鹽結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明超聲微波輔助提取的粗毛纖孔菌多糖對(duì)甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉的結(jié)合率優(yōu)于熱水浸提法和超聲波輔助法，呈劑量依賴性，對(duì)牛磺膽酸鈉的結(jié)合率高于甘氨膽酸鈉。本研究結(jié)果表明超聲微波協(xié)同提取可增加IHP的提取率促進(jìn)IHP的膽酸鹽結(jié)合能力，為粗毛纖孔菌多糖開(kāi)發(fā)成為一種降血脂功能食品提供理論依據(jù)，但其體內(nèi)降脂的具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究探討。