SPME-GC-MS分析與鑒別青海亞麻籽油揮發性組分

韓玉澤，王興瑞，李應霞，王淑珍，陳昀昀，王進英,2,

（1.青海大學農牧學院，青海西寧 810016；2.青海大學，三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，青海西寧 810016）

亞麻又稱胡麻，是一種特色的油料作物。亞麻作為我國五大油料作物之一，在我國種植面積廣，主要分布在華北、西北等高寒地區，是河北、甘肅、新疆、青海等地的特種油料作物。亞麻籽中含有對人體有益的α-亞麻酸、蛋白質、膳食纖維、酚類物質等多種功能成分[1]，在預防心血管疾病和癌癥，降低骨吸收率、抗炎、抗抑郁等多方面均具有重要作用[2?4]。

亞麻籽油具有獨特的風味，其風味成分是影響感官特性、品質的重要因素，快速、準確地分析亞麻籽油中的揮發性成分，可為亞麻籽油的品質控制、進一步優化加工貯藏條件提供理論依據[5?6]。目前，國內外對食品中風味物質的萃取方法主要包括溶劑萃取法、同時蒸餾萃取法[7]、超臨界流體萃取[8]、頂空固相微萃取[9?11]等。頂空固相微萃取是一種針對樣品揮發性成分進行采集的新型技術，它將被分析物從樣品基質中吸附到纖維上，然后被解吸到分析儀器中進行分析，具有費用低、操作簡單、準確性高、節約樣品制備時間等優點[12]。近年來，SPME-GC-MS被廣泛應用于多種植物油香氣成分的分析鑒別。Dierkes等[13]對95個不同品質的橄欖油風味成分進行分析，共得到21種香氣物質。于文龍等[14]研究了不同加工工藝的亞麻籽油中揮發性物質構成，檢測出熱榨亞麻籽油特征香氣成分16種，冷榨亞麻籽油揮發性成分14種，共有香氣成分7種。楊柳等[15]采用頂空結合氣質聯用對油茶籽油、大豆油、菜籽油等食用油揮發性成分進行鑒別，發現不同植物油均有其特征性揮發性組分且對其檢測效果良好。大量研究表明，SPME是植物油揮發性物質較為合適的萃取方法。

本實驗以青海本地亞麻籽為研究對象，通過對固相微萃取條件優化，并結合氣質聯用分析亞麻籽油中揮發性成分的組成，建立了青海亞麻籽油風味物質最佳檢測方法，為亞麻籽油品質鑒定與分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青海亞麻籽 40種，由實驗室索氏抽提（料液比0.06 g/mL、抽提溫度70 ℃，抽提時間8 h）制得亞麻籽油，編號S1~S40，具體信息見表1。

表1 亞麻籽油信息表Table 1 Information of flaxseed oil

QP 2020 NX GC-MS聯用儀 日本島津公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）萃取纖維頭、固相微萃取手柄、SPME專用磁力加熱攪拌裝置、15 mL采樣瓶 美國Supelco；JA1003電子天平 上海良平儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 揮發性成分的萃取 實驗方法參照文獻[11]進行，將萃取頭置于260 ℃進樣口老化60 min，直至無干擾峰出現。取6.0 g青海亞麻籽油置于15 mL采樣瓶中，放入磁力攪拌子后立即用帶有聚四氟乙烯硅膠隔墊的蓋子將其密封壓緊，將樣品瓶置于80 ℃磁力加熱攪拌器上，以400 r/min的速率攪拌加熱20 min，使亞麻籽油揮發性組分充分平衡，之后將活化好的萃取頭穿過硅膠隔墊，推出纖維頭，頂空萃取40 min。迅速將萃取頭插入氣相色譜進樣口，250 ℃條件下解吸5 min。每兩次進樣分析間需將萃取頭置于250 ℃進樣口洗脫10 min，以保證纖維頭的高效性。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：InertCap pure-wax色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至220 ℃，保持10 min。高純氦氣（99.999%）流速1.0 mL/min，分流比50:1，進樣口溫度250 ℃。

1.2.3 質譜條件 電子轟擊（EI）電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度為260 ℃；離子源溫度150 ℃；燈絲發射電流200 μA；質量掃描范圍m/z 35~350 amu。

定性定量：揮發性成分通過NIST譜庫進行檢索，與標準物質譜圖分析對比進行定性分析，當相似度>80%時，確定為該物質。采用面積歸一化法，依據峰面積分析各組分的相對百分含量。

1.2.4 SPME條件的優化

1.2.4.1 攪拌速率的確定 選用DVB/CAR/PDMS作為萃取頭，固定條件為：萃取溫度70 ℃、平衡時間30 min、吸附時間40 min、解吸時間5 min，考察攪拌速率0、200、400、600、800 r/min對青海亞麻籽油揮發性成分萃取效果的影響。

1.2.4.2 萃取溫度的確定 選用DVB/CAR/PDMS作為萃取頭，固定條件為：攪拌速率400 r/min、平衡時間30 min、吸附時間40 min、解吸時間5 min，比較萃取溫度50、60、70、80、90 ℃對青海亞麻籽油揮發性成分萃取效果的影響。

1.2.4.3 平衡時間的確定 選用DVB/CAR/PDMS作為萃取頭，固定條件為：攪拌速率400 r/min、萃取溫度80 ℃、吸附時間40 min、解吸時間5 min，比較平衡時間10、20、30、40、50 min對青海亞麻籽油揮發性成分萃取效果的影響。

1.2.4.4 吸附時間的確定 選用DVB/CAR/PDMS作為萃取頭，固定條件為：攪拌速率400 r/min、萃取溫度80 ℃、平衡時間20 min、解吸時間5 min，比較吸附時間20、30、40、50、60 min對青海亞麻籽油揮發性成分萃取效果的影響。

1.2.4.5 解吸時間的確定 選用DVB/CAR/PDMS作為萃取頭，固定條件為：攪拌速率400 r/min、萃取溫度80 ℃、平衡時間20 min、吸附時間40 min，比較解吸時間1、3、5、7、9 min對青海亞麻籽油揮發性成分萃取效果的影響。

1.2.5 升溫程序的優化 為使各目標物更好的分離，選用植物油揮發性成分測定常用的wax色譜柱，參考文獻[11]對升溫程序進行優化。

1.2.6 樣品聚類分析 將40批樣品的揮發性成分作為變量，導入SPSS23.0數據分析軟件中，選取組間連接法，以歐式距離為標準對樣品進行聚類分析。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel及SPSS23.0對數據進行處理、統計；用Origin 2018軟件分析所有數據并繪制圖表；各實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 SPME條件的優化

2.1.1 攪拌速率對萃取效果的影響 攪拌可以加速食用油中揮發性成分的揮發與吸附，因此在亞麻籽油頂空固相微萃取的過程中使用磁力加熱攪拌器以減少萃取時間，使揮發性成分更快達到萃取平衡。由圖1可以看出，攪拌速率從0增至800 r/min的過程中，峰個數與總峰面積均呈現先上升后下降的趨勢。隨著攪拌速率增大，不僅加快了樣品中待測物由液相向氣相的擴散速率，同時增大了亞麻籽油中含量少及揮發性低的揮發物的揮發度。當攪拌速率為400 r/min時峰個數與總峰面積均達到最大值，說明在該攪拌速率下樣品中揮發性成分達到平衡狀態。繼續增大攪拌速率萃取效果反而變差，可能是由于過高的攪拌速率導致磁力攪拌子不穩定，因此選擇400 r/min為最佳攪拌速率。

2.1.2 萃取溫度對萃取效果的影響 SPME對食用油中揮發性成分的提取與富集是一個動態平衡過程。隨著萃取溫度的升高，分子運動速度加快，進而使樣品中揮發性成分的擴散系數增大，縮短了萃取時間。當溫度過高時，樣品分配系數減少，降低了萃取頭對揮發性成分的吸附，降低萃取效率[16]。由圖2可以看出，隨萃取溫度升高，峰個數不斷增加，但是總峰面積在萃取溫度80 ℃達到最高點后反而開始下降，分析其原因可能是在過高溫度下，樣品發生變質，脂肪酸分解生成一定數量的低分子氧化產物，與風味物質競爭頂部空間導致峰面積下降[16]。同時，頂空固相微萃取吸附過程屬于放熱反應[17]，在過高的溫度下不利于樣品中揮發性成分的吸附。綜合考慮，選擇80 ℃為最佳萃取溫度。

圖2 萃取溫度對萃取效果的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction effect

2.1.3 平衡時間對萃取效果的影響 由圖3可知，在平衡時間內，揮發物種類與總峰面積呈先升高后降低的趨勢，這表明一定的平衡時間可以使更多的揮發物從樣品中釋放出來，在平衡時間20 min時檢測出樣品中揮發性成分最多有57種，由于揮發性成分的釋放與溶解呈動態平衡過程，繼續增加平衡時間會使釋放出的揮發物重新溶解，導致揮發物總量下降[18]，因此當平衡時間為20 min時，揮發物的釋放程度最大，具有最佳的萃取效果。

圖3 平衡時間對萃取效果的影響Fig.3 Effect of equilibration time on the extraction effect

2.1.4 吸附時間對萃取效果的影響 由圖4可知，吸附時間20~40 min之間，峰個數與總峰面積均呈上升趨勢，在40 min時達到最大值，吸附時間延長峰個數與總峰面積反而開始緩慢下降。說明在一定的時間內，隨著萃取時間延長，可檢出的樣品中的香氣成分增加，同時峰面積增大，但是過長的萃取時間會導致已經吸附在萃取頭上的目標物重新解析出來，從而造成萃取量的降低，綜合考慮，最佳的萃取時間為40 min。

圖4 吸附時間對萃取效果的影響Fig.4 Effect of adsorption time on extraction effect

2.1.5 解吸時間對萃取效果的影響 待樣品中揮發性成分完全吸附到萃取頭上后，將萃取頭插入250 ℃的GC進樣口進行解吸。時間過短不能將揮發性成分從萃取頭上完全解吸下來，影響檢測結果的準確性，同時也會對下一樣品產生污染。當解吸時間過長，萃取頭長時間處于高溫環境中會縮短其壽命。由圖5可知，解吸時間為1~5 min內，揮發物的種類及總峰面積呈上升趨勢，5 min以后則趨于平緩，說明解吸時間5 min時目標物基本解吸完全。故選5 min作為最佳萃取時間。

圖5 解吸時間對萃取效果的影響Fig.5 Effect of desorption time on extraction effect

2.2 升溫程序的選擇

在萃取條件優化的基礎上對GC-MS升溫程序進行優化，以使各目標物更好地分離，同時得到理想峰型。試驗探究了以下兩個升溫條件對分離效果的影響：升溫程序A：初溫36 ℃，保留5 min，以3 ℃/min升至100 ℃，保持5 min，以8 ℃/min升至180 ℃，保持10 min。升溫程序B：初溫40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至220 ℃，保持10 min。

如圖6所示，各目標物在升溫程序A、B的條件下進行升溫操作，整個升溫過程在50 min左右，在這個時間段，兩個程序都可以使目標物得到較好地分離，由于程序B升溫速率較快，目標物在38 min之前基本全部出峰，同時目標物在較高溫度下出峰，得到的峰型理想。此外，相比程序B，程序A中最后的目標物由于是在較低的溫度下出峰，因此使得整個峰高較低。綜上，升溫程序B效果好于升溫程序A。

圖6 不同升溫程序下亞麻籽油揮發性成分的總離子流圖Fig.6 Total ion chromatograms of volatile components of linseed oil under different heating programs

2.3 青海亞麻籽油揮發性組分分析

揮發性香氣成分是評價植物油品質的重要指標，對植物油整體香氣起著重要作用[19]。以優化后的SPME條件萃取青海亞麻籽油中揮發性成分，經GC-MS檢測初步鑒定出青海40種浸提亞麻籽油含有揮發性成分共58種，主要包括醛類、酸類、醇類、酮類、酯類、烷烯類、雜環類、其他類物質。如表2所示，從各品種揮發性成分的主要構成看，醛類和烷烯類化合物數量最多，相對含量也最高，最高分別占總揮發性成分的54.82%和53.75%。酸類、醇類化合物數量分別為8、9種，其相對含量最高分別為26.03%、8.16%。酮類、酯類、雜環類種類較少，分別含有2、5、3種。由于醛類揮發性成分的風味閾值相對較低，且大多數的醛類物質具有較強的香氣，因此，醛類化合物對青海亞麻籽油整體風味起主導作用；烷烯類化合物是主要存在于植物性食品中具有植物固有的清香的一類物質，但其性質不穩定且閾值較高，因而對亞麻籽油風味貢獻不大；同時相對含量較低的醇類、酯類也因其閾值較高，而對亞麻籽油風味貢獻較低。

表2 不同類別亞麻籽油揮發性成分的相對含量（%）Table 2 Relative content of volatile components in different classifications of flaxseed oil (%)

植物油中的揮發性成分生成途徑主要包括美拉德反應和脂質氧化，美拉德反應生成呋喃、吡嗪、吡咯等，脂質氧化生成醛、酮等物質[20]，由于樣品是通過索氏抽提制取的亞麻籽油，因此美拉德反應程度較低，多數揮發性成分是由于脂肪酸氧化而產生，可以發現亞麻籽油的風味貢獻物質主要是醛類物質中的反-反-2,4-庚二烯醛，其是亞麻酸的主要氧化產物，具有脂肪、水果香等香氣。該揮發性成分幾乎存在于各品種中，且相對含量較高，在40個樣品中的平均含量達到11.03%，因此被認為是亞麻籽油的特征風味物質，這與王笑園等[21]的研究結果一致。同時，油脂氧化生成的短鏈次生氧化產物也會產生不愉快的氣味，進而影響亞麻籽油的整體風味。

2.4 青海亞麻籽油揮發性成分聚類分析

植物油風味主要取決于樣品的品種、成熟度、種植區域、氣候條件、加工工藝、貯藏條件[22?23]。運用SPSS 23.0軟件，采用組間連接對40個青海亞麻籽油樣品進行聚類分析，以平方歐氏距離為度量標準得到青海亞麻籽油揮發性成分組成的聚類譜系圖。

由圖7知，通過聚類分析可以較好地將40種青海亞麻籽油樣品區分開。歐氏距離可以表征樣品的相似度，歐氏距離越小表明樣品的相似度越高可歸為一類[24]。當距離為20時，所有樣品可以聚為兩大類，S35單獨一類，其余樣品為一類；當類間距離為10時，亞麻籽油樣品可以聚為三大類，S35為一類，S22、S37、S39、S40可歸為一類，其余35個樣品聚為一類，表明以揮發性組分為指標進行聚類分析可以將40批亞麻籽油樣品進行區分。

圖7 40個亞麻籽油樣品聚類譜系圖Fig.7 Cluster pedigree map of 40 flaxseed oil samples

結合表2可以發現，S35中揮發性成分種類極少，使得烷烯類與雜環類的相對百分含量明顯高于其他樣品，與其他樣品有較大差距；4個樣品（S22、S37、S39、S40）中醛類物質具有較高的相對含量，因此被單獨聚為一類。分析原因可能是此類樣品中亞麻酸、亞油酸含量較高，而醛類物質通常是由亞油酸、亞麻酸氧化生成，故其含量高于其他品種。

3 結論

本研究比較了攪拌速率、萃取溫度、平衡時間、解吸時間、吸附時間五個因素對青海亞麻籽油揮發性成分數量及峰面積的影響，結果表明當攪拌速率400 r/min、萃取溫度80 ℃、平衡時間20 min、吸附時間40 min、解吸時間5 min時萃取效果最好。

采用優化后的HS-SPME-GC-MS條件檢測并結合聚類分析對青海40種亞麻籽油中揮發性成分進行分析比較。結果表明，40種青海亞麻籽油樣品中共檢測出58種揮發性成分，包括醛類12種，酸類8種，醇類9種，酮類2種，酯類5種，烷烯類13種，雜環類3種，其他類6種。醛類物質對亞麻籽油整體風味具有突出作用，其中反-反-2,4-庚二烯醛是亞麻籽油的特征風味物質。

根據聚類分析可知，40個品種可以分為3個類群，同一類群之間揮發性成分組成類似，不同類群之間存在差異，可能與亞麻籽油品種、成熟度、種植條件相關。同時，由于脂肪氧化對亞麻籽油風味的形成起到重要作用，因此有必要進行后續試驗，分析亞麻籽油中脂肪酸含量及組成與脂質氧化形成揮發性成分的關系。該研究結果對青海亞麻籽油特征風味物質及其開發利用提供了一定的理論依據。