一步式QuEChERS方法結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛肉中25種磺胺類藥物殘留

謝瑜杰，李鐵梅，牛相濤，張艷俠，扈 斌，吳興強(qiáng)，范春林，陳 輝,

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南 250101）

磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）是一類含有磺胺酰胺化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物，由于該類藥物療效好、價(jià)格低，且具有良好的抗菌作用，已被廣泛用作細(xì)菌感染性疾病的預(yù)防和治療劑[1?4]。除此之外，磺胺類藥物也被當(dāng)作飼料添加劑使用，對(duì)犢牛和豬進(jìn)行增肥[5]，同時(shí)也可廣泛用于動(dòng)物育種，治愈動(dòng)物疾病并提高其抗菌能力。磺胺類藥物的大量使用造成其在肉類產(chǎn)品中廣泛殘留。

肉類作為當(dāng)前消費(fèi)者獲取蛋白的主要來(lái)源，質(zhì)量安全也越來(lái)越受重視。磺胺類藥物多用于治療細(xì)菌感染，其使用量對(duì)動(dòng)物而言接近中等毒性，因此，磺胺類藥物在動(dòng)物體內(nèi)的殘留水平通常較高[6]。雖然磺胺類藥物通過(guò)乙酰化后不會(huì)在人體內(nèi)積聚，但是，濫用磺酰胺會(huì)誘使各種細(xì)菌產(chǎn)生對(duì)藥物的強(qiáng)烈耐藥性，極大地危害人體健康[5?7]。因此，建立一種快速檢測(cè)磺胺類藥物的方法尤為重要。

目前磺胺類藥物殘留主要檢測(cè)方法有HPLC[8?9]、HPLC-MS/MS[10?12]、HPLC-Q-TOF-MS[13]和HPLCQ-Orbitrap[14]等技術(shù)。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其高靈敏度、高選擇性及定量定性準(zhǔn)確等特性，成為目前獸藥殘留應(yīng)用最普遍的檢測(cè)技術(shù)[11,15?16]。而針對(duì)畜禽肉的前處理方法，常見(jiàn)的凈化方式有固相萃取柱凈化[7,17]、液液萃取[18]和QuEChERS方法[19?20]。QuEChERS方法是當(dāng)前主流前處理方法，主要應(yīng)用于簡(jiǎn)單基質(zhì)，而對(duì)于動(dòng)物性復(fù)雜基質(zhì)很少使用。有文獻(xiàn)報(bào)道QuEChERS可用于魚(yú)肉、豬肉等動(dòng)物性食品的凈化，可有效去除雜質(zhì)干擾[20?21]。與其他前處理方法相比，傳統(tǒng)QuEChERS方法節(jié)省了大量時(shí)間，但仍需要人員手動(dòng)完成提取和凈化兩個(gè)步驟。而一步式QuEChERS是一種通過(guò)設(shè)置儀器參數(shù)可在短時(shí)間同時(shí)完成提取和凈化兩個(gè)步驟的全自動(dòng)儀器，該方式操作簡(jiǎn)單，可減少人為參與，提高實(shí)驗(yàn)效率和實(shí)現(xiàn)重復(fù)性[22]，一步式QuEChERS整合管如圖1所示。本文建立了一步式QuEChERS結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)牛肉中25種磺胺類藥物。該方法簡(jiǎn)單快速、定量準(zhǔn)確，可以為牛肉中磺胺類藥物殘留檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

圖1 一步式QuEChERS整合管裝置Fig.1 One-step QuEChERS centrifuge tube

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛肉樣品 購(gòu)于超市；苯甲酰磺胺、磺胺醋酰、磺胺氯噠嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺脒、磺胺甲基嘧啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺惡唑、磺胺、磺胺苯吡唑、磺胺吡唑、磺胺吡啶、磺胺喹噁啉、磺胺噻唑、磺胺二甲異嘧啶、磺胺異噁唑、甲氧芐啶25種磺胺類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 純度≥97%，天津阿爾塔公司；乙腈 色譜純，美國(guó)Fisher公司；乙酸、無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉、乙酸鈉、無(wú)水硫酸鈉 分析純，北京化工廠；乙酸銨 色譜純，Acros Organics公司；C1850 μm，天津博納艾杰爾公司；N-丙基乙二胺（PSA） 40~60 μm，天津博納艾杰爾公司；碳十八鍵合鋯膠（Z-Sep+） 美國(guó)Supelco公司；增強(qiáng)型基質(zhì)去除吸附劑（EMR-Lipid） 美國(guó)安捷倫公司；鋯珠、雙層離心管 北京本立科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水Milli-Q超純水。

Agilent 1290高效液相色譜儀和Agilent 6460三重四極桿質(zhì)譜儀 配有電噴霧離子源（ESI），美國(guó)安捷倫公司；H-30全自動(dòng)均質(zhì)儀 中國(guó)廈門睿科儀器有限公司；SiO-6512 QuEChERS自動(dòng)樣品制備系統(tǒng) 北京本立科技有限公司；N-EVAP 112型氮吹儀美國(guó)Organomation Associates 公司；3-30 K型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma 公司；Milli-Q超純水儀美國(guó)Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取10 mg（精確至0.01 mg）標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，于?18 ℃避光保存；根據(jù)需要，移取適量?jī)?chǔ)備液，用甲醇稀釋，配制所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃避光保存。

1.2.2 樣品的前處理 稱取2 g（精確至0.01 g）均勻牛肉樣品于50 mL雙層離心管外管中，加入20 mL的1%乙酸乙腈，10000 r/min均質(zhì)1 min，加入1.5 g乙酸鈉和6顆鋯珠，將內(nèi)管與外管擰緊（內(nèi)管中含100 mg PSA，100 mg C18，200 mg無(wú)水硫酸鎂）后放入QuEChERS自動(dòng)樣品制備儀器中，開(kāi)始自動(dòng)處理樣品。處理結(jié)束后取內(nèi)管中上清液2 mL進(jìn)行氮吹，氮吹至近干后用2 mL甲醇:水（2:8，v:v）定容，過(guò)0.22 μm濾膜，待LC-MS/MS檢測(cè)。

1.2.3 QuEChERS儀器參數(shù) 儀器工作程序設(shè)定為第一次振蕩轉(zhuǎn)速：1100 r/min；時(shí)間：10 min；第一次離心轉(zhuǎn)速：4500 r/min；時(shí)間：5 min；第二次振蕩轉(zhuǎn)速：1100 r/min；時(shí)間：5 min；第二次離心轉(zhuǎn)速：4500 r/min；時(shí)間：5 min。

1.2.4 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（3 mm×150 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相：A為0.2%甲酸2 mmol/L 乙酸銨溶液，B為0.2%甲酸甲醇溶液；洗脫梯度：0~0.5 min，5% B，0.5~3 min，5%~15% B；3~10 min，15%~40% B；10~18 min，40%~100% B；18~22 min，100% B；22~22.1 min，100%~5% B；22.1~24 min，5%B；24~26 min，5% B。

1.2.5 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓；4.0 kV；離子源溫度：350 ℃；去溶劑氣流：氮?dú)猓?1 L/min；去溶劑溫度：325 ℃；錐孔氣流：氮?dú)猓? L/min；碰撞氣壓：0.4 MPa。其他參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 25種磺胺類藥物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters for the 25 sulfonamides

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和Origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

2.1.1 色譜條件優(yōu)化 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)磺胺類藥物流動(dòng)相多使用乙腈[23]和甲醇[4]，本實(shí)驗(yàn)參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第197號(hào)-10-2019[24]的洗脫梯度條件，對(duì)比了乙腈和甲醇兩種有機(jī)流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)甲醇作為流動(dòng)相時(shí)可以提高分離效率，同時(shí)改善色譜峰形，同時(shí)為了兼顧流動(dòng)相pH，本實(shí)驗(yàn)最終選擇0.2%甲酸甲醇溶液作為有機(jī)流動(dòng)相。

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 在最佳色譜條件下，對(duì)1 μg/mL的25種磺胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行采集，通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜掃描獲得相應(yīng)的母離子，并通過(guò)優(yōu)化噴霧電壓、噴霧器溫度等質(zhì)譜參數(shù)獲得最優(yōu)離子源參數(shù)；隨后通過(guò)子離子掃描選擇信號(hào)強(qiáng)且穩(wěn)定的碎片離子，分別確定定性離子及定量離子，進(jìn)一步優(yōu)化碎裂電壓、碰撞能量等參數(shù)，得到目標(biāo)化合物的MRM質(zhì)譜參數(shù)，具體見(jiàn)表1。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化 磺胺類化合物為弱極性化合物，易于被乙腈或酸化乙腈提取[25]，同時(shí)牛肉基質(zhì)相對(duì)復(fù)雜，含有大量的蛋白和脂肪等干擾物，乙腈作為提取液時(shí)，可使蛋白沉淀[26]。因此，本文對(duì)乙腈及酸化乙腈進(jìn)行優(yōu)化以選取最優(yōu)提取條件。結(jié)果如圖2所示，當(dāng)乙腈作為提取液時(shí)，4種化合物回收率小于70%，而酸化乙腈使所有化合物的回收率均提高10%左右，當(dāng)提取液為2%的乙酸乙腈時(shí)，磺胺的回收率高于120%。因此，本文選擇1%乙酸乙腈作為提取液，25種磺胺類化合物回收率均在70%~120%之間。

2.2.2 提取體積及提取次數(shù)的優(yōu)化 為了優(yōu)化提取效率，對(duì)比了1%乙酸乙腈10 mL提取1次，提取2次和20 mL提取1次三種不同的提取次數(shù)和體積。由于10 mL提取液用量太少，借助自動(dòng)QuEChERS設(shè)備不能進(jìn)入內(nèi)管中，因此，本實(shí)驗(yàn)在對(duì)比提取液用量時(shí)選擇使用手動(dòng)前處理方法。結(jié)果見(jiàn)圖3，10 mL提取1次時(shí)，除磺胺脒外，其余化合物回收率均高于70%，而10 mL提取2次及20 mL提取1次的回收率全部在70%~120%之間。為了減小工作量，本實(shí)驗(yàn)選擇20 mL提取1次，并與自動(dòng)QuEChERS前處理方法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)手動(dòng)前處理方法與借助自動(dòng)QuEChERS設(shè)備前處理結(jié)果無(wú)顯著差距，各目標(biāo)化合物回收率均大于70%。為了提高檢測(cè)效率，本實(shí)驗(yàn)最終選擇提取液體積為20 mL提取一次，通過(guò)自動(dòng)QuEChERS設(shè)備進(jìn)行提取。

圖3 不同提取方式對(duì)化合物回收率的影響Fig.3 Effect of different extraction methods on compound recovery

2.3 凈化填料的優(yōu)化

對(duì)于牛肉樣品，凈化的難點(diǎn)在于如何有效去除脂肪干擾物。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，增強(qiáng)型去除脂類基質(zhì)吸附劑EMR-Lipid可去除脂肪[27]，Z-Sep+可用于去除脂肪干擾物[28]，C18可有效去除牛肉中的脂肪和酯類；PSA可去除脂肪酸、有機(jī)酸、色素等極性物質(zhì)。本文對(duì)比了500 mg EMR-Lipid、50 mg Z-Sep++200 mg C18+200 mg無(wú)水硫酸鎂、200 mg PSA+200 mg C18+200 mg無(wú)水硫酸鎂三組填料的凈化效果。從圖4可以看出，使用Z-Sep+凈化后磺胺噁唑的回收率高于120%外，其余化合物的回收率均在70%~120%之間。使用另外兩組填料時(shí)，目標(biāo)化合物的回收率范圍均在70%~120%之間，考慮到EMR-Lipid在使用前需要用水活化，增加前處理步驟，最終選擇PSA+C18+無(wú)水硫酸鎂進(jìn)行凈化。

乙腈1%乙酸乙腈2%乙酸乙腈(%)率收回160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40磺胺二甲嘧啶磺胺甲氧噠嗪磺胺甲基嘧啶磺胺鄰二甲氧嘧啶磺胺喹噁啉磺胺甲噁唑磺胺對(duì)甲氧嘧啶 磺胺吡唑 磺胺苯吡唑磺胺間甲氧嘧啶磺胺間二甲氧嘧啶磺胺吡啶磺胺氯吡嗪磺胺氯噠嗪磺胺二甲異嘧啶磺胺嘧啶磺胺噻唑磺胺惡唑甲氧芐啶 磺胺異噁唑磺胺甲噻二唑 磺胺苯甲酰磺胺磺胺醋酰磺胺脒化合物名稱

圖4 不同填料對(duì)化合物回收率的影響Fig.4 Effect of different adsorbents on compound recovery

由于牛肉中含水量較少，主要去除的干擾物是蛋白質(zhì)和脂肪，因此本文主要優(yōu)化C18和PSA用量，對(duì)無(wú)水硫酸鎂只考察使用和不使用時(shí)對(duì)化合物回收率的影響。對(duì)比C18用量為100、200和300 mg時(shí)的回收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著C18用量的增加，部分化合物的回收率會(huì)降低，當(dāng)用量為100 mg時(shí)，25種化合物的回收率均在70%~120%之間，詳見(jiàn)圖5。對(duì)比PSA用量發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用量為100 mg時(shí)，目標(biāo)化合物的回收率均在70%~120%之間，且回收率明顯高于200 mg和300 mg，詳見(jiàn)圖5；在C18和PSA用量均為100 mg時(shí)，對(duì)未使用無(wú)水硫酸鎂和用量200 mg時(shí)目標(biāo)化合物回收率進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用無(wú)水硫酸鎂時(shí)多種化合物的回收率高于未使用無(wú)水硫酸鎂時(shí)化合物的回收率，以苯甲酰磺胺最為明顯。因此，本文選擇的最佳凈化填料組合為PSA 100 mg、C18100 mg和無(wú)水硫酸鎂200 mg。

圖5 不同填料用量對(duì)化合物回收率的影響Fig.5 Effect of different adsorbent dosage on compound recovery

2.4 定容液的選擇

本文使用的流動(dòng)相為0.2%甲酸（含2 mmol/L NH4Ac）水溶液和0.2%甲酸甲醇溶液，且初始流動(dòng)相為95%水相，因此，定容液的選擇也尤其重要。在相同濃度下，對(duì)比了不同定容液對(duì)目標(biāo)化合物的影響，當(dāng)乙腈和甲醇作為定容液時(shí)，目標(biāo)化合物響應(yīng)均較低，溶劑效應(yīng)明顯，尤其以極性較大的化合物最明顯，如磺胺。因此對(duì)定容溶液進(jìn)一步優(yōu)化，主要增加水的比例，選擇甲醇:水（8:2、5:5、4:6:2:8）四種情況，以磺胺為例，當(dāng)定容液接近初始流動(dòng)相時(shí)，即甲醇:水（2:8）時(shí)磺胺響應(yīng)逐漸提高，且峰形逐漸改善，見(jiàn)圖6。

圖6 不同定容液對(duì)化合物的影響Fig.6 Influence of different constant volume solutions on compounds

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

以陰性空白樣品提取液作為溶劑，配制100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其峰面積為A；以甲醇為溶劑配制100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定其峰面積為B。基質(zhì)效應(yīng) ME（%）=B/A×100。根據(jù)受到基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱，將基質(zhì)效應(yīng)分為三類：ME%值低于?20%表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)；ME%值介于?20%和20%之間表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)；ME%值高于20%表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。結(jié)果表明：25種磺胺類化合物均為弱基質(zhì)效應(yīng)，見(jiàn)表2。為了定量更準(zhǔn)確，本文采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量。

表2 牛肉中25種磺胺類化合物的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effect for 25 sulfonamides in beef

2.6 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.6.1 線性范圍、檢出限與定量限 在陰性樣品中添加目標(biāo)化合物，按照1.3步驟測(cè)定，以信噪比S/N≥3對(duì)應(yīng)添加水平作為檢出限（LOD），信噪比S/N≥10對(duì)應(yīng)的添加水平作為定量限（LOQ），結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示該方法的檢測(cè)限在1~3 μg/kg之間，定量限在1~10 μg/kg之間。25種磺胺類化合物在0.1~20 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均高于0.990（見(jiàn)表3）。

表3 磺胺類藥物線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear range, regression equation, correlation coefficient, LOD and LOQ of SAs

2.7 回收率與精密度

為了考察方法的準(zhǔn)確度和精密度，對(duì)陰性牛肉樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。分別選擇1倍LOQ、2倍LOQ和10倍LOQ的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液作為添加水平，按前述方法進(jìn)行前處理，每個(gè)添加水平測(cè)定5個(gè)平行。同時(shí)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)，扣除本底值后計(jì)算添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。牛肉中25種化合物在1倍LOQ、2倍LOQ和10倍LOQ添加水平下的回收率分別為70.44%~116.93%、70.14%~91.73%和72.14%~93.62%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為0.95%~12.17%、4.07%~13.74%和1.18%~10.74%，結(jié)果見(jiàn)表4，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足準(zhǔn)確定量的要求。

表4 準(zhǔn)確性和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 4 Accuracy and precision of the method (n=5)

2.8 實(shí)際樣品測(cè)定

應(yīng)用本文建立的檢測(cè)方法對(duì)8份市售牛肉樣品中25種磺胺類化合物進(jìn)行了測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果顯示，25種磺胺類化合物在市售牛肉樣品中均未檢出。

3 結(jié)論

本研究建立了自動(dòng)QuEChERS結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測(cè)牛肉中25種磺胺類合成抗菌藥物。對(duì)提取液、提取方式、凈化條件及定容液等方面進(jìn)行優(yōu)化，最終選取1%乙酸乙腈作為提取液，PSA+C18+無(wú)水硫酸鎂（1+1+2，質(zhì)量比）凈化提取液，HPLC-MS/MS檢測(cè)，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，該方法具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高，降低了基質(zhì)干擾等優(yōu)勢(shì)，可推廣用于以牛肉為代表的畜禽肉中25種磺胺類合成抗菌藥物的檢測(cè)。