2’-巖藻基乳糖對益生菌定殖及抗炎能力的影響

楊文君，劉同杰，梁 曦，張 喆，崔慶宇，呂優優，公丕民，易華西，章檢明，劉大群，張蘭威,

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266000；2.浙江省農業科學院，浙江省農業綠色生物制造核心菌種改良重點實驗室，浙江杭州 310021）

壞死性小腸結腸炎（Necrotizing enterocolitis，NEC）是新生兒常見的消化道疾病，炎癥反應是導致其發生的重要危險因素之一[1?2]。國內外研究表明母乳低聚糖或益生菌可以通過抑制炎癥反應的發生，降低嬰幼兒患NEC的概率[3?5]。2’-巖藻基乳糖（2’-Fucosyllactose，2’-FL）是母乳中含量較高的低聚糖[6]，其具有許多重要的生理功能，如促進益生菌粘附、增殖[7]，促進腸道細胞分化成熟[8]，增強腸道黏膜屏障[9?10]，抑制致病菌侵襲[11]，維持腸道菌群平衡等。2’-FL可能在抑制嬰幼兒NEC炎癥反應發生中發揮重要作用，臨床研究表明喂養添加2’-FL配方奶粉的嬰兒血漿中炎性細胞因子的含量顯著低于喂食普通配方奶粉的嬰兒，這些炎性細胞因子含量下降了29%~83%[12]。體外研究表明2’-FL可以作為拮抗劑，抑制免疫受體TLR5和TLR7，防止發生過度免疫反應；還可以通過抑制炎癥因子的產生來抑制脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）介導的細胞炎癥反應[13?14]。

益生菌則可以通過降低炎癥因子的表達，抑制NEC炎癥反應的發生[15]。臨床研究表明補充益生菌制劑的NEC患兒的炎癥因子（TNF-α、IFN-γ、IL-6）含量顯著降低，炎癥的嚴重程度隨之降低[16]。體外研究同樣展現出益生菌抑制炎癥細胞表達炎癥因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的抗炎作用[17?18]。

現有研究表明母乳低聚糖的混合物可以促進益生菌定殖[19]，協助益生菌發揮益生功能，但具體是哪些低聚糖在發揮作用并不是十分清晰。2’-FL是母乳中含量較高的低聚糖，其對益生菌定殖能力和抗炎作用的影響還未見報道。因此本實驗探討了2’-FL對乳酸菌和雙歧桿菌增殖、粘附腸道細胞能力的影響，并利用LPS誘導的Raw264.7細胞炎癥模型，篩選出可以抑制NEC相關炎性因子的乳酸菌和雙歧桿菌，進一步探討2’-FL的添加對這些菌株抗炎效果的影響，為開發特殊嬰幼兒配方奶粉提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Man Rogosa Sharp（MRS）肉湯培養基、MRS無碳源培養基 青島海博生物技術有限公司；胰蛋白酶、DMEM高糖培養基 北京索萊寶生物技術有限公司；青霉素-鏈霉素混合溶液、Triton-X-100、5（6）-羧基二乙酸熒光素琥珀酰亞胺酯（CFDA-SE） 碧云天生物技術公司；細胞活性檢測（CCK-8）試劑盒GLPbio公司；特級胎牛血清 BI公司；NO試劑盒南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α、白介素（IL）-6、IL-1β、IL-10試劑盒 蘇州卡爾文生物科技有限公司；脂多糖（LPS）來源于大腸桿菌055 B5Sigma-Aldrich公司；2’-巖藻基乳糖 丹尼斯克（中國）有限公司；Caco-2細胞、Raw264.7細胞 中國科學院細胞庫；實驗所用雙歧桿菌菌株：兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）FL-276.1和FL-228.1；乳酸菌菌株包括：口乳桿菌（Lactobacillus oris）MN-33、FN-448、FN-473、FN-519、ML-329，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）MN-431、FN-518、FN-470，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）MN-169、FN-16，干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、FN-345、FN-377、ML-446，糞腸球菌（Enterococcus faecalis）MN-77、FN-19、ML-506、FN-313、ML-1、ML-2，屎腸 球 菌（Enterococcus faecium）FN-515、FN-249、FN-500、FN-484、ML-523、FN-483，腸球菌（Enterococcussp.）ML-237，鳥腸球菌（Enterococcus avium）ML-490 保藏于實驗室菌庫；鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）LGG 購買自ATCC細胞庫；實驗所用其它試劑均為國產分析純。

SW-CJ-1D超凈工作臺 蘇州凈化儀器有限公司；LDWZX-75KBS高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械有限公司；LRH-250生化培養箱 上海一恒儀器有限公司；PB-10酸度計 賽多利斯儀器有限公司；CKX53熒光倒置顯微鏡 日本OLYMPUS公司；TG20KR-D高速冷凍離心機 長沙東旺儀器有限公司；MW80二氧化碳培養箱 上海皓莊儀器有限公司；VARIOSKAN FLASH全波長多功能酶標儀賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株活化與菌懸液制備 實驗菌株按照2%接種量接種于MRS液體培養基。37 ℃培養20 h活化。活化第3代的菌株培養液于4 ℃，6500 ×g條件下離心4 min，收集菌體，菌體用PBS緩沖液洗滌三次，最后用PBS或者DMEM培養基重懸，菌體懸液濃度按照下述實驗的具體要求進行調整[20]。

1.2.2 2’-FL對乳酸菌和雙歧桿菌增殖的影響 無碳源的MRS培養基中添加2.5 mg/mL的2’-FL或葡萄糖，將活化的第3代實驗菌株培養液以2%接種量接種到上述培養基中，37 ℃培養24 h后測定發酵液的OD600nm和pH。分別以不添加碳源培養基和含葡萄糖培養基為空白對照和陽性對照，比較2’-FL對實驗菌株增殖的效果[21]。

1.2.3 細胞培養 Caco-2細胞、Raw264.7細胞以DMEM完全培養基（含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合液）于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，每兩天換液1次，待細胞生長至80%，用胰蛋白酶將細胞消化成單層，進行傳代培養[22]。

1.2.4 菌株熒光標記 CFDA-SE用二甲基亞砜配制成1 mmol/L的溶液，經0.22 μm濾膜過濾。每1 mL PBS重懸的菌體懸液（約為109CFU/mL）添加20 μL CFDA染液，混勻，37 ℃避光孵育20 min。標記的菌體懸液于4 ℃，6500 ×g離心4 min，去除上清液。菌體沉淀用PBS洗滌3次，最后用DMEM培養基重懸并調整濃度為4×108CFU/mL[23]。

1.2.5 2’-FL對乳酸菌和雙歧桿菌粘附Caco-2細胞的影響 Caco-2細胞以2×105個/mL，接種于48孔板，每2 d換液1次。待Caco-2細胞生長為緊密單層，用PBS洗滌細胞層以除去抗生素，2’-FL干預組加入含有2’-FL（終濃度為2.5 mg/mL）的100 μL DMEM培養基及100 μL熒光標記的4×108CFU/mL的菌體懸液，對照組加入100 μL DMEM培養基及100 μL熒光標記的菌體懸液。37 ℃孵育2 h后，用PBS緩沖液洗滌3次，將未粘附的菌洗脫。加入100 μL 0.5% TritonX-100溶液處理5 min，之后加入100 μL PBS緩沖液。收集孔內的液體，用酶標儀測定其熒光強度。吸收光波長為488 nm，發射光波長為518 nm。細菌的粘附率為細菌粘附細胞并用PBS洗脫后的熒光強度同細菌粘附細胞前的熒光強度的比值。2’-FL對菌株粘附細胞的影響結果用粘附倍數，即2’-FL干預組細菌的粘附率同對照組細菌的粘附率的比值表示[24]。

1.2.6 菌株對細胞增殖的影響 Raw264.7細胞以2×104個/孔接種100 μL于96孔板，細胞貼壁8 h可用于實驗。實驗菌株（2’-FL可以促進增殖或粘附的菌株）按照1.2.1的方法，制成DMEM重懸的菌體懸液，并調節濃度為107CFU/mL。實驗菌干預組細胞加入100 μL DMEM重懸的菌體懸液，對照組細胞加DMEM培養基。于細胞培養箱中培養16 h后每孔加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃避光孵育2 h，于酶標儀450 nm波長處測定吸光度值（OD450nm）。計算時各組細胞需減去DMEM培養基的吸光度值[25]。

式 中：A2為 干 預 組OD450nm；A1為 對 照 組OD450nm；A0為培養基OD450nm（空白調零值）。

1.2.7 2’-FL對細胞增殖的影響 2’-FL干預組細胞加入100 μL含有終濃度為1.25、2.5、5、10 mg/mL的2’-FL的DMEM培養基。其它條件同1.2.6。

1.2.8 潛在抗炎菌株的篩選 Raw264.7細胞以2×105個/孔接種于24孔板，細胞貼壁8 h后更換成實驗分組的培養基。其中LPS模型組細胞的DMEM培養基中含有終濃度為100 ng/mL的LPS，實驗菌干預組除LPS外還含有終濃度為107CFU/mL的實驗菌（所用菌株為2’-FL可以促進增殖或粘附且不會對細胞增殖產生明顯副作用的菌株），對照組只加DMEM培養基。干預16 h后，收集細胞培養上清液，用相應的試劑盒并按照說明書的方法，依次測定上清液中的細胞因子NO、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10含量[18,26?27]。

1.2.9 2’-FL對LPS誘導的Raw264.7細胞炎癥的調節作用 2’-FL干預組除含LPS外還含有終濃度為5 mg/mL的2’-FL。其余同1.2.8。

1.2.10 聯合干預組對LPS誘導的Raw264.7細胞炎癥的調節作用 各組細胞按照表1實驗分組所示更換各組的DMEM培養基。其余同1.2.8。

表1 實驗分組Table 1 Experimental groups

1.2.11 聯合干預組對LPS誘導的Raw264.7細胞形態的影響 按1.2.10中的方法干預，16 h后在倒置顯微鏡中觀察細胞形態并拍照[27]

1.3 數據處理

所有實驗均重復3次。實驗結果通過獨立樣本T檢驗或單因素方差分析進行統計學分析，并采用Duncan檢驗進行多重比較分析實驗數據間的差異性，其中P<0.05為具有顯著性差異，所用分析軟件為SPSS 20.0。實驗做圖均采用Prism8.0軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 2’-FL對乳酸菌和雙歧桿菌增殖的影響

由圖1A可以看出，在2’-FL添加培養基中，30株菌中只有兩株雙歧桿菌FL-276.1和FL-228.1的OD600nm值較不添加碳源培養基顯著增加（P<0.05），其他乳酸桿菌和腸球菌的OD600nm值無顯著性差異（P?0.05），因此可以確定2’-FL能促進FL-276.1和FL-228.1增殖。FL-276.1利用2’-FL作為碳源增殖的效率低于利用葡萄糖（P<0.05），而FL-228.1利用2’-FL的增殖效率優于利用葡萄糖（P<0.05），這表明2’-FL促增殖效果具有菌株差異性。Yu等[21]研究了25株菌利用2’-FL進行增殖的情況。結果同本研究結果相一致的是實驗中的雙歧桿菌可以代謝2’-FL，但鼠李糖乳桿菌、糞腸球菌和梭菌等則不能代謝2’-FL。本實驗結果表明2’-FL可以特異性促進兩歧雙歧桿菌FL-276.1和FL-228.1的增殖，但促進效果具有菌株差異性。

圖1 2’-FL對乳酸菌和雙歧桿菌OD600 nm（A）和pH下降值（B）的影響Fig.1 Effects of 2’-FL on the OD600 nm（A） and pH drop（B） of lactic acid bacteria and Bifidobacteria

由圖1B可以看出，與對菌株增殖的影響相一致，兩歧雙歧桿菌FL-276.1和FL-228.1在添加2’-FL培養基中的pH下降值顯著高于不添加碳源培養基（P<0.05）。其他乳酸桿菌和腸球菌在添加2’-FL培養基中的pH下降值與不添加碳源培養基沒有顯著性差異（P?0.05），低于在葡萄糖培養基中的pH下降值。本實驗結果表明2’-FL可以被特定的雙歧桿菌利用產酸，但是難以被乳酸桿菌、腸球菌等乳酸菌利用。2’-FL是母乳中含量較高的巖藻基低聚糖，其不能被嬰兒消化吸收，但可以被腸道中的益生菌利用[29]。本研究結果顯示可以利用該糖進行增殖和產酸的益生菌株較少，兩歧雙歧桿菌可能因為含有可以代謝巖藻基乳糖的糖苷酶[29]，因此能夠利用2’-FL進行增殖和產酸，這有助于增強其競爭性定殖于嬰幼兒腸道的能力。

2.2 2’-FL對乳酸菌和雙歧桿菌粘附Caco-2細胞能力的影響

從圖2中可以看出2’-FL可以顯著提高乳酸菌（ML-1、FN515、FN518、FN249、ML329）和雙歧桿菌（FL-276.1）粘附Caco-2細胞的能力（P<0.05）。且2’-FL的促進粘附效果具有菌株差異性，同為雙歧桿菌，僅有FL-276.1的粘附能被2’-FL促進。已有的研究結果表明一些母乳低聚糖可以促進益生菌粘附腸道細胞。Zhang等[30]的實驗結果顯示2’-FL可以促進兩歧雙歧桿菌在Caco-2細胞上粘附，這與本實驗中2’-FL顯著促進兩歧雙歧桿菌FL-276.1粘附的結果相一致。Kong等[7]的研究表明2’-FL可以促進乳桿菌粘附Caco-2細胞。在本實驗中2’-FL則顯示出對鼠李糖乳桿菌FN518的促進粘附效果。益生菌的粘附能力是其在嬰幼兒腸道中定殖的重要影響因素[7]。2’-FL可以促進乳酸菌和雙歧桿菌粘附腸道細胞，因此有助于這些菌株在嬰幼兒腸道中定殖，更好地發揮益生功能。

圖2 2’-FL對乳酸菌和雙歧桿菌粘附Caco-2細胞的能力的影響Fig.2 Effect of 2’-FL on the adhesion of lactic acid bacteria and bifidobacterial to Caco-2 cells

2.3 潛在抗炎菌株的篩選

選擇2’-FL可以促進增殖或粘附的菌株，即乳酸菌（ML-1、FN515、FN518、FN249、ML329）和雙歧桿菌（FL-276.1、FL-228.1），進一步研究它們對巨噬細胞Raw264.7炎性反應的改善作用。從圖3A中可以看出乳酸菌和雙歧桿菌不能促進Raw264.7細胞增殖，可能是因為乳酸菌和雙歧桿菌在干預細胞的過程中會和細胞競爭營養，并產酸，改變了細胞的生存環境，對其增殖有一定的毒害作用。因此，選取對細胞有害影響相對較小即細胞增值率大于85%的菌株用于后續抗炎菌株的篩選，包括FL-276.1、FL-228.1、FN518、ML-1、ML329和FN515。

圖3 乳酸菌和雙歧桿菌對Raw264.7細胞的增殖及細胞因子分泌的調節作用Fig.3 Regulatory effects of lactic acid bacteria and Bifidobacteria on Raw264.7 cell viability and the secretion of cytokines

LPS誘導Raw264.7細胞，刺激細胞產生NO、TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子，誘導細胞發生炎性反應[18]。本研究選擇依次降低炎癥因子NO、TNFα、IL-1β、IL-6的順序篩選抗炎菌株，并依次淘汰不達標菌株。結果從圖3B-F中可以看出LPS組的NO、TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度顯著高于對照組（P<0.05），表明細胞正在進行過度炎癥反應。研究表明益生菌能夠通過降低細胞炎癥因子的分泌和增加抗炎因子的分泌來減輕細胞的炎癥損傷[18,26,31]。本研究中的FL-276.1、FL-228.1、FN518能顯著降低LPS誘導產生的4種炎性因子NO、TNF-α、IL-1β和IL-6（P<0.05），且對抗炎因子IL-10的產生無顯著負面影響。因此，以上3株菌相比于其它實驗菌株是潛在的抗炎菌株。它們可能通過抑制炎癥因子的產生，進而阻斷炎癥級聯反應的發生，從而減輕細胞的炎癥反應[26]。

2.4 2’-FL對Raw264.7細胞的增殖及其細胞因子分泌的調節作用

從圖4A中可以看出不高于5 mg/mL的2’-FL對Raw264.7細胞增殖無顯著的毒害作用，結合圖4B可以看出，2’-FL顯著降低（P<0.05）由LPS誘導Raw264.7分泌的炎性指示物NO，且呈劑量效應關系，這一結果與He等[13]的結果相似。因5 mg/mL的2’-FL抑制炎癥效果最好，后續實驗均采用該濃度。從圖4C~圖4F中可以看出2’-FL可以降低由LPS刺激產生的IL-6和IL-1β，不能顯著降低TNFα和增加IL-10的產量（P<0.05）。研究表明，2’-FL可以通過降低炎癥因子的含量，減輕炎癥反應[12?13]。本實驗結果表明在終濃度為5 mg/mL的體系中，2’-FL可顯著降低由LPS誘導的Raw264.7中NO、IL-6和IL-1β的產量（P<0.05），顯示了一定的抗炎能力。

圖4 2’-FL對Raw264.7細胞的增殖及細胞因子分泌的調節作用Fig.4 Regulatory effects of 2’-FL on Raw264.7 cell viability and the secretion of cytokines

2.5 潛在抗炎益生菌與2’-FL聯用的抗炎效果

由前述結果可知，2’-FL單獨使用不會顯著降低LPS誘導產生的TNF-α，但從圖5B1和圖5B2中可以看出2’-FL與FL-276.1或FL-228.1聯用后則可以顯著降低TNF-α的分泌（P<0.05）。2’-FL單獨使用可以顯著降低分泌的炎癥因子NO和IL-1β在與乳酸菌和雙歧桿菌聯用后，降低效果更顯著（P<0.05）。從圖5中還中可以看出2’-FL與FL-276.1、FL-228.1和FN518聯用都顯著降低了炎癥因子的分泌（P<0.05），但因菌株本身的抗炎效果具有差異性，2’-FL與菌株聯用后表現為不同的炎癥因子的分泌下降。相比單用FL-276.1，聯用可顯著降低IL-6和IL-1β的分泌（P<0.05）；相比FL-228.1，聯用可顯著降低IL-1β的分泌（P<0.05）；相比FN518，聯用可顯著降低NO的分泌（P<0.05），然而，2’-FL對N518抑制TNF-α的產生卻有不利影響。由以上實驗結果可知，2’-FL與乳酸菌和雙歧桿菌聯用，總體可以發揮協同抗炎的效果，但因菌株差異效果有所差別。其中2’-FL與FL-276.1協同降低的炎癥因子最多，協同效果最好。Duncan等[32]的實驗發現牛乳低聚糖與鼠李糖乳桿菌或羅伊氏乳桿菌聯用可以在體外減輕艱難梭菌毒素A對T84細胞的破壞。其結果同本實驗中益生菌與低聚糖聯用具有協同作用，且聯用的保護效果會因為菌株不同而存在差異性的結果相一致。

圖5 2’-FL與乳酸菌和雙歧桿菌聯用對Raw264.7細胞的增殖及細胞因子分泌的調節作用Fig.5 Regulatory effects of combined use of 2’-FL and lactic acid bacteria and Bifidobacteria on the secretion of cytokines of Raw264.7

2.6 對Raw264.7細胞形態的影響

從圖6中可以看出，對照組Raw264.7細胞為橢圓形，LPS模型組細胞形態不規則且具有偽足，模型構建成功[33]。2’-FL添加組發生不規則變化和產生偽足細胞的比例減少，表明2’-FL可以減弱LPS誘導的細胞形態變化。雙歧桿菌FL-276.1、FL-228.1或鼠李糖乳桿菌FN518也可以在一定程度上降低LPS造成細胞形態的不規則變化，但不能完全抑制，且不同菌株的抑制效果不同。2’-FL和菌株聯用后對細胞形態變化的抑制效果更好，其中FL-276.1和2’-FL共同干預組抑制細胞形態變化的作用最強。細胞形態發生不規則變化的比例減少的同時，會伴隨著炎癥因子的分泌減少[33]。這也與本研究中FL-276.1和2’-FL協同降低的炎癥因子最多的結果相一致。

圖6 乳酸菌和雙歧桿菌或2’-FL以及二者聯合作用對Raw264.7細胞形態的影響Fig.6 Effects of lactic acid bacteria and Bifidobacteria or 2’-FL and the combination of the two on the morphology of Raw264.7 cells

3 結論

綜上所述，2’-FL可以促進雙歧桿菌FL-276.1和FL-228.1增殖，可以提高雙歧桿菌FL-276.1和乳酸菌（ML-1、FN515、FN518、FN249、ML329）粘附細胞的能力，可以與潛在抗炎菌株（兩岐雙歧桿菌FL-276.1和FL-228.1、鼠李糖乳桿菌FN518）發揮協同抗炎作用。即2’-FL可以提高乳酸菌和雙歧桿菌的定殖（粘附、增殖）能力與抗炎作用，但作用效果具有菌株差異性，該結果可以為緩解壞死性小腸結腸炎的炎癥反應提供理論基礎，為開發功能性嬰兒配方奶粉提供新的思路。但本研究中2’-FL協同菌株抗炎的作用機制，以及2’-FL對益生菌定殖和抗炎作用的影響在體內是否同樣可以發揮作用，都有待進行深入的研究。