復合菌制劑設計及其在食品發酵中應用的研究進展

王藝欣，張 健 ，井月欣，王共明，劉 芳，田秀慧，劉 奎，劉海超，韓 爽，鐘靜詩

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.山東省海洋資源與環境研究院，山東煙臺 264006）

發酵是一種古老的食品加工保存技術[1]。發酵過程中，不同微生物之間復雜的相互作用將原料中的碳水化合物、脂肪和蛋白質等大分子物質降解成更容易吸收的小分子活性物質[2]，從而提高營養利用率，改善食品的質地、適口性、感官特性和消化率，延長產品的保質期[3]。一些發酵產物還能夠調節人體的免疫系統，起到降低某些疾病風險的作用[4]。自然發酵過程中環境的變化和微生物種類的波動，可能會影響發酵食品的質量[5]和安全性[6]。因此，選擇具有理想功能特性，且通過鑒定確認毒理學安全性的，能夠提供標準風味和期望代謝活性的菌株[7]作為食品發酵工業發酵劑，是保障發酵食品品質和安全性的必要條件。

目前，在環境和經濟等因素的影響下，消費者對健康的、具有地方特色的傳統發酵產品的需求促使傳統發酵與現代生物技術的融合發展。相對于單一菌制劑，復合菌制劑能夠模擬自然發酵中多種微生物的協同作用，在提高生產效率的同時，能夠更好的還原傳統發酵食品的風味特性[8]，已成為當下發酵工藝研究的熱點之一。為此，本文從復合菌制劑的研究進展、制備方法、設計優化以及其在傳統的發酵食品和發酵水產品中的應用等方面進行了綜述。

1 復合菌制劑概述

1.1 現代工業發酵劑

現代食品發酵工業中，將傳統發酵食品中的優勢菌株分離出來做發酵劑，以達到縮短發酵時間，實現大規模工業生產[9]，提高產品質量和穩定性的目的[10]。目前常用作食品發酵劑的菌株如表1所示。

傳統發酵食品發酵過程中，發酵環境等[22]因素的變化會影響產品的品質。如醬油釀造過程中按照“春曲、夏醬、秋油”的時序實現發酵過程中菌種的生長代謝平衡。為了改善自然發酵的不穩定性，實現發酵產品的工業化大規模生產，發酵劑在現代工業發酵中得到了廣泛的應用。與自然發酵相比，外接發酵劑有以下優勢[23?24]：

a. 可提高發酵體系中有益菌株的濃度，發酵過程中酸含量增加，降低或抑制腐敗致病菌對發酵產品安全性的影響；

b. 使得發酵過程人為可控，不受環境等外界因素的影響。根據不同需求添加發酵劑，縮短發酵周期，降低發酵成本，提高發酵產量；

c. 可以降低發酵過程中產生的有害物質的含量，更好地保障發酵食品的安全性。

現代工業發酵劑一般所用菌種單一[25]，發酵過程中產生的生化反應相對簡單，不能夠滿足生化過程復雜、成分多樣的發酵食品生產。在純種發酵思維的影響下，近年來發酵工業上所用到的混菌發酵劑不能夠很好的發揮菌種間的協同增效作用，且難以控制發酵過程中菌種的生長代謝平衡[26]，往往會造成產品多樣性和地域性風味的缺失。目前商業化的發酵劑所面臨的挑戰之一，即如何能夠在大規模生產中提高產品穩定性，且能改善工業發酵導致的風味單一化的問題。

1.2 復合菌制劑及其特點

復合菌制劑是為獲得更加全面的發酵效果將兩種或兩種以上的有特定功能的菌株混合制成的微生物制劑[27]。用于配制復合菌制劑的微生物，都是經過鑒定具有一定的安全性，能夠表現出期望代謝活性并有利于發酵過程的菌株。菌種復合后有利于保存自然發酵產品風味多樣性、提高產品的產量[28]。與純菌發酵劑相比，多菌復合構成一個相對完整的生物體系，以微生物之間的相互作用為橋梁，維持良好的發酵環境，得到具有期望特性的產品[29]。

自20世紀80年代，有學者通過研究菌種之間的相互作用提出，根據各菌種的優勢組合不同活菌制劑的設想[30]。此后科研人員在復合菌制劑的研制和應用方面進行了大量研究。

目前，國內外已有大量關于復合菌制劑在發酵食品方面的研究。學者們普遍認為復合菌制劑發酵食品能夠充分利用原料，提高產品的營養價值、改善產品的風味品質[31]。如納豆芽孢桿菌與乳酸菌復合發酵能夠提高全豆豆乳中的粗蛋白、粗脂肪和一些風味物質的含量[32]；多菌復合制曲發酵高鹽稀態醬油通過改善醬油發酵過程中的酶系，改善醬油的風味，大大提高了醬油的品質[33]；韓德權等[34]認為多菌復合發酵劑發酵蔬菜的感官品質和營養價值高出市售一倍不止。復合菌制劑發酵有提高產品的穩定性和安全性，延長貨架期的作用。Zhao等[35]發現復合菌制劑發酵過程中羊肉香腸的pH、水分活度（Aw）迅速下降，抑制腐敗菌和致病菌的生長。Saithong等[36]通過對比自然發酵與復合菌制劑發酵Plaa-som發現，復合菌發酵產品的酸度遠高于自然發酵。此外，復合菌制劑發酵可以節約工業生產成本，以復合菌制劑發酵泡菜為例，不僅可以縮短發酵周期，還提高了發酵過程的穩定性，減少用鹽量，從源頭減少泡菜高鹽廢水的排放量[37]。

2 復合菌制劑設計

2.1 設計原則

復合菌制劑的設計，首先要了解自然發酵食品中微生物體系之間的相互作用。明確發酵食品中微生物之間的相互作用關系，有利于開發出具有相應特色的復合菌制劑，從而生產出質量穩定、品質優良的發酵食品。復合菌制劑的設計應堅持以下原則，一是選擇混合菌種的種類應遵循少而精的原則[27]；二是復合菌制劑的設計一般遵循互利共生和偏利共生等協同相互作用，即[38?39]：

a. 發酵過程中，不同微生物間均能從對方受益，相互促進對方的生長代謝；

b. 發酵過程中，一種微生物促進另一種微生物的生長代謝的同時，本身不受影響。

利用微生物之間的協同作用，在優勢效應的影響下，發揮各菌種自身的優勢，從而提高復合菌制劑的綜合功能。

2.2 復合菌制劑制備

復合菌制劑的制備過程如圖1[40]。

圖1 工業復合菌制劑的制備流程Fig.1 Preparation process of industrial compound bacteria preparation

2.2.1 劑型的選擇 一般發酵劑按照物理狀態可分為液態和粉劑兩種。液態發酵劑是將分離純化的菌株活化后，擴大培養制成的以液體狀態保存的發酵劑。粉末狀發酵劑是將富集培養后的菌株離心，制備菌懸液，再通過真空冷凍干燥或者噴霧干燥等方法制備而成的。復合菌制劑一般以粉劑為主[41]。這是因為與液態發酵劑相比，粉劑體積小，更易保存，不易受到雜菌的污染，用于生產時可以直接投入，不需活化，縮短了生產周期。

2.2.2 菌種的選擇 微生物的群體種類和之間的相互作用，影響著發酵食品的質量和安全性。篩選具有優良性狀的發酵優勢菌種，研究各菌種間互生和拮抗特性，對制備科學合理的發酵劑菌種搭配方案很重要。

復合菌制劑的菌種選擇方法通常可分為兩種。一是利用具有地方特色的傳統發酵產品中分離篩選出來的并具有一定代表性的優勢菌株進行復配。傳統發酵產品中的優勢菌能夠更好地適應生態環境和加工條件，更有效地開發和控制產品[42]。此外，其發酵過程中釋放的酶，有助于生產具有地域特色的發酵食品。通過使用影響發酵食品風味質地的具有本土特色的復合菌制劑，不僅能夠改善發酵產品口感單一的問題，還可以開發出具有地區典型特性的標準化安全食品[43]。石建喜等[44]將從傳統發酵鰱魚肉中分離出的植物乳桿菌、釀酒酵母和木糖葡萄球菌制成復合發酵劑發酵鰱魚肉發現，不僅可以抑制發酵過程中的腐敗菌和致病菌的生長，還能夠產生積極的特色發酵風味。

另一種方法則是將已知特點的有益菌株復配應用于食品的發酵過程中，以達到增加風味物質、延長保質期或者減少有害物質生成等商業目的。例如，阮一凡等[45]將植物乳桿菌和釀酒酵母復合應用開發發酵鴨腿產品，用來抑制產品脂肪的氧化、感官的劣變和分解發酵過程中產生的不良生物胺。Palavecino等[46]將清酒乳桿菌分別和小牛葡萄球菌與木糖葡萄球菌復合發酵香腸用于降低發酵過程產生的硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）。

2.2.3 現代生物學技術在菌種選擇中的應用 通過現代生物學技術手段，認識發酵過程中微生物的形態和特性，研究微生物屬性及其在發酵過程中潛在的代謝能力[47]，揭示了發酵微生物與發酵食品的風味形成機制，為不同功能的復合菌制劑的復配提供了十分有力的保障。基因組學為復合菌制劑菌種的選擇過程提供了理論依據。近年來，現代分子生物學的飛速發展，基因分析檢測技術被應用于發酵食品微生物群落的研究中，如表2所示。

表2 常用菌種檢測技術Table 2 Common bacteria detection technology

2.3 復合菌制劑設計優化方法

在發酵工藝中，影響發酵產品品質的因素有很多，如菌種接種量，發酵條件和發酵培養基的成分等。優化發酵工藝條件對提高發酵產品質量和數量起著重要作用。復合菌制劑的制備過程中對其制備技術參數的優化和發酵工藝的優化同樣重要。李銀娜[51]通過單因素法對嗜酸乳桿菌復合菌種發酵稀奶油生產工藝進行優化，得出當發酵溫度為39 ℃，復合菌種配比為1:1:1:1，接種量為7%時，發酵稀奶油中活菌數最高且產品酸味柔和，組織狀態細膩平滑，無乳清析出，凝乳時間縮短。胡強等[52]利用正交設計試驗對動物源益生菌和植物源益生菌復合菌劑發酵調味筍工藝影響因素進行探討及優化，提高了發酵產品中腸道益生菌、花青素及膳食纖維等有益因子含量，得到一條良好的新型復合菌發酵調味筍生產工藝流程。單因素法和正交試驗應用于發酵產品工藝優化，極大程度地降低了工作量，提高篩選效率。但是兩者都不能得出最適因素和響應值之間的回歸方程，即無法找到整個區域的最適因素組合和最優響應值。

隨著計算機技術的快速發展，利用計算機統計軟件輔助優化篩選過程的研究已經成為現實。科學家們在單因素實驗和正交試驗的基礎上構建高效實驗設計，將SPSS、SAS、STATISTIC等計算機統計軟件引用到設計優化實驗的結果分析中，準確、高效地得出優化結論。常用的優化方法有Plackett-Burman設計、最陡爬坡試驗、響應面試驗等。邢慧雅[53]基于模糊數學統計的基礎上，利用響應面優化得出當接種量2.8%，發酵時間10 h，菌種的比例為2:1時，藜麥濃漿的感官評分最高。盧蕓等[54]通過利用單因素法和Plackett-Burman設計等篩選出顯著影響扇貝邊醬發酵的因素，通過響應面優化分析得出最優化的扇貝邊醬發酵工藝。

3 復合菌制劑在食品加工中的應用

復合菌制劑在食品加工中常用于發酵調味制品、谷類制品、飲料和酒類、肉制品、蔬菜等。微生物發酵能夠利用由各種酶類降解蛋白質、脂肪、碳水化合物等大分子物質所形成的氨基酸、脂肪酸、單糖等小分子代謝產物進行初級代謝和次級代謝，形成多種揮發性代謝產物[55]。因此在食品的發酵過程中微生物的多樣性對提升產品品質、改善產品風味有著非常重要的實際意義。

3.1 在酒飲料發酵中的應用

隨著人們對大曲中微生物的深入研究和現代生物技術的不斷發展，人工接種純菌強化大曲是，最常用的提高原料利用率、開發新產品的一種方法。但這種方法對傳統的發酵生產大曲的生物穩定性與協調性有影響。針對這一問題，陳雪玲等[56]提出用復合菌制劑制備強化大曲以減少人工接種對大曲穩定性和協調性的影響。實驗證明利用復合菌劑強化大曲在提高大曲的感官等級的同時其糖化力、液化力、發酵力、酯化力等也顯著的提高。研究表明當釀酒酵母（S.cerevisiae）與非釀酒酵母（Non-Saccharomyces）復合發酵，會使得發酵酒飲料的香味成分多樣化，突出其品種特色和地域特征[57]。釀酒酵母與美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）發酵后櫻桃酒中的高級醇、酯類、萜類物質含量增加能夠改善酒體的風味[58]。此外，多菌復合能夠改善酒制品的口感和色澤。如東方伊薩酵母與釀酒酵母復合能夠降低產品中的酵母味和澀味，改善產品的口感[59]；釀酒酵母與地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）復合發酵醬香白酒，使得白酒的醬香味更加的醇厚[60]；朱娟娟等[61]表示不同酵母復合發酵劑發酵紅葡萄酒，酒體的顏色更加傾向紅葡萄酒陳釀。一些非釀酒酵母[62]和乳酸菌[63]等添加到復合菌制劑中，能夠降低酒精度數。

3.2 在肉制品發酵中的應用

發酵肉制品是指原料肉在自然或者人為控制的條件下，經過微生物的特定作用，提高肉制品酸性，形成風味質地獨特、儲存時間久的新型肉制品[64]。商業發酵劑發酵肉制品，雖能夠縮短生產周期，但是在風味和質感方面略顯單一。有學者研究發現，復合菌制劑能夠增加肉制品中醛、酮類物質[65]，改善肉制品的嫩度[66]。由此可見，復合菌制劑發酵能夠改善肉制品的風味品質。

復合發酵劑還能夠抑制有害微生物的增殖和有毒成分的產生。實驗證明，乳酸球菌和清酒乳桿菌能夠明顯抑制肉制品中單核細胞增生李斯特菌等肉制品中的腐敗菌和致病微生物的生長，并能夠降低肉制品發酵過程中生物胺的含量[67?68]。Sun等[69]在哈爾濱干腸中添加清酒乳桿菌、戊糖乳桿菌及彎曲乳桿菌復合發酵，發酵結束后產品的亞硝酸鹽含量顯著下降。盧涵等[13]利用植物乳桿菌和葡萄球菌接種豬肉發酵制作香腸，測定整個過程中蛋白質和脂肪的氧化情況，并與自然發酵過程對比發現，使用復合發酵劑制香腸的TBARS值顯著低于自然發酵，這說明復合發酵劑發酵肉制品有一定的抑制脂質過氧化的作用。近年來，研究發現一些微生物（如：腸桿菌、庫特氏菌屬等）可以有效地改善肉制品的色澤，在此基礎上，樊康[70]將乳酸菌希臘魏斯菌與植物乳桿菌復合發酵肉制品發現，肉制品色澤鮮艷，可代替亞硝酸鹽對發酵肉制品進行護色。

3.3 在谷類制品發酵中的應用

發酵谷類制品種類多樣，常見的有面包、饅頭、米糕等。我國北方多以面食為主，饅頭是最常見的傳統發酵食品之一。為了改善當前商品化加工饅頭風味同化的問題。有學者對發酵酸面團中的微生物組成進行了分析，發現發酵過程中起主要是酵母菌和乳酸菌[71]。只有在多種酵母菌和乳酸菌的共同作用下進行發酵，才能夠賦予酸面團發酵制品獨特的質地和風味[72]。劉晨[73]參考西方國家對于酸面團風味的研究，對復合菌制劑發酵和活性干酵母發酵的饅頭進行分析得出，復合菌制劑饅頭中風味物質高于活性干酵母饅頭。復合菌制劑發酵能夠有效地延緩淀粉的老化、減少抗營養因子并延長保質期，使得成品質地細膩且香甜可口、具有較高的咀嚼性及凝聚性[74]，更符合消費者對食品營養保健、安全健康的要求。比如，利用復合菌制劑發酵的苦蕎麩皮饅頭綜合品質優于單一酵母發酵的饅頭[75]；酵母菌復合菌制劑能夠有效的改善米粉的口感和香味[76]。此外，吳寒等[77]利用植物乳桿菌與米根霉復合發酵燕麥發現，必需氨基酸含量顯著增加。因此，復合菌制劑發酵有一定的提高谷類制品營養價值的作用。

3.4 在水產品加工中的應用

發酵水產品是一類風味獨特的發酵食品[78]。數千年以來，世界各地基于不同的飲食文化發展出了種類眾多的具有不同風味、口感、食用方式等特點的水產品。

3.4.1 在水產調味料中的應用 水產調味料（如耗油、蝦醬、魚露等）因為其營養豐富、風味獨特受到人們的青睞[79]。以一些水產品的下腳料為主要原料[80]，利用復合菌制劑發酵可制成富含氨基酸氮的天然調味料[81]，不僅能夠提高產品的質量和穩定性，還能夠進一步提高水產品的利用率。研究人員在單一菌種發酵的基礎之上，外接復合菌制劑發酵蝦醬發現，產品中的有害物質、鹽含量減少，呈味氨基酸含量增加且生成速度加快[82]。劉燁[80]將四種單一菌種發酵制成的海帶醬油與多菌種混合發酵的海帶醬油進行對比發現，多菌種混合發酵產生的醬油氨基態氮含量遠遠高于單一菌種發酵，并且醬油顏色鮮艷，有光澤，并且帶有獨特的醬香味，甜咸適口，味道鮮美，氨基酸態氮的含量高達2.91%。這說明，復合菌制劑發酵水產調味品有一定增加產品風味色澤的作用。

3.4.2 在發酵魚制品中的應用 魚肉經過微生物發酵之后，蛋白質和脂肪被分解為氨基酸和脂肪酸，并且氨基酸和脂肪酸等小分子物質在降解的過程中能夠形成發酵魚制品所特有的風味成分。復合菌制劑發酵魚肉制品能夠有效縮短發酵時間、提高產品的營養價值和品質風味。目前，芽孢桿菌和葡萄球菌已經被用作發酵魚產品的復合菌制劑[83]；植物乳桿菌、木糖戊球菌和釀酒酵母也被制成復合菌制劑用于提高酸魚的風味[84]。于沛沛等[85]利用復合菌制劑發酵鰱魚結果表明，產品的組胺和酪胺含量下降，遠低于安全標準。由此可知，復合菌制劑能夠降解發酵過程中的有害物質，提高發酵產品的安全性。

在魚露的生產過程中，Gao等[86]提出，利用產蛋白酶的嗜鹽微生物做發酵劑可以有效地加速魚露的發酵。Akolkal等[87]從不同的發酵魚制品中分離得三株具有產蛋白酶活性的嗜鹽菌，將其制成復合菌制劑進行發酵，與對照組對比發現，魚露的發酵時間明顯縮短。Zheng[88]和Lee[89]等分別利用psychrobacter sp-1和多黏芽孢桿菌做發酵劑發現sp-1可以用于改善魚露的質量，多黏芽孢桿菌減少了魚類發酵過程中組胺和生物胺。

4 展望

隨著生活水平的提高，食品安全問題日益受到人們的關注，消費者對發酵食品的安全性和營養價值的要求越來越高，純菌發酵食品逐漸難以滿足人們的需求。復合菌制劑的配制及其對發酵食品的影響已成為當下發酵食品的研究熱點之一。目前，國內大型發酵企業在不斷的探索開發存活率高、穩定性強、發酵性能好、能夠實現地域性發酵食品獨特口感的新型發酵劑。近年來，功能性食品不斷地受到市場的追捧，不少研究者對益生菌復合發酵功能性食品進行了初步的研究，比如Jhan等[90]將紅豆在保加利亞乳桿菌和納豆芽孢桿菌共同發酵下，抗氧化物質的濃度明顯提高；李燕[91]以乳酸菌、紅曲霉和黑曲霉共同發酵果醋發現，產生抑制膽固醇合成Monacolin K的物質。相關研究為其工業化生產提供了數據支撐，也為復合菌制劑中菌種的選擇和配置提供了理論依據。

目前水產品主要以冰鮮冷凍銷售為主，附加值相對較低，不利于商業價值的提升。水產品經過發酵加工不僅可以除去特有的腥味，還可以獲得獨特的風味物質及功能物質，有助于進一步提高產品的安全性及商業附加值。復合菌制劑應用于水產品發酵中，必將進一步推動發酵水產品產業的發展。