薄膜過濾法和直接接種法在口罩無菌檢測中的應用比較

郭文琴 楊丹

摘要：目的：比較鹽酸氯丙嗓注射液的無菌檢查方法，采用直接接種法和薄膜過濾法，進行無菌檢查。結果：直接接枝法更易受污染，控制周期更長，薄膜過濾法更短，效率更高。結論：薄膜過濾法更容易操作，污染更小，壽命短。

關鍵詞：鹽酸氯丙嗓注射液;薄膜過濾法;無菌檢查

1 引言

根據2020版中國藥典規定，氯化物鹽酸鹽的滅菌監測表明，鹽酸氯丙嗓注射液通過直接注射產生的一段時間，3天后會出現渾濁。3 天如果按照藥劑師的規則，它是需要更換種子或染色劑和顯微鏡后確認結果。觀察明確的培養基，便于判斷測試結果，監測周期短。作者比較了監測兩種方法的效果，報告如下。《中國藥》2000年版規定注射劑的無菌檢查有直接接種法與薄膜過濾法。一般小容量注射劑采用直接接種法，大容量注射劑采用薄膜過濾法。隨著科學技術的進步，抑菌劑的發展和一次性加熱系統（抑菌劑）的改進，使得膜過濾器的操作更加容易，應用也更加廣泛。本文以1%的地卡因注射劑和10%的普魯卡因注射劑為例，討論小劑量膜過濾的可能性，并與直接注射進行比較。

2 儀器與試藥、菌株

HTY-2000智能細菌收集器和全放電細菌收集器（杭州醫療器械廠）。鹽酸氯丙嗓注射液無錫制藥廠，規格為2m。劑量為50mg，批號為0501020。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色梭狀芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉 LCMCC。液體容器硫乙醇酸鹽改變培養基軍事培養基，營養培養基增加培養基，鈉不透明培養基，營養培養基改良。沖洗液為氯化鈉蛋白陳緩沖液培養基，pH=7.0，按參考方法配制，高壓蒸汽滅菌。細菌收集器HTY-2000型Py 220型全封閉細菌提取器（杭州古鼎醫療設備有限公司）標準SW-Cy-IB衛生座（100級蘇州周加工設備廠）MJ 160。MJ-160L型霉菌培養箱（上海華聯環境試驗設備公司），PYX- DHS隔水式電熱恒溫培養箱（上海市醫療器械批發部）。

注射用鹽酸100種（10米1/瓶）（我院生產批號：030103.030429.031029）氯化氫注射裝置100支（10毫升/瓶）（批號：30 30307.03 0513.國產）03103液體液液體硫乙醇酸鹽培養基。薄膜過濾法：取10瓶10%的過氧化氫，每批號注入10%，收集培養基。通過放置在防霉、防水培養箱中并在特定溫度下生長的殺菌收集器，將每個100m1鹽酸普魯卡因注射液泵入各自的細菌收集器。每天，是否有細菌滋生。另取一管空容器，直接配制金黃色葡萄球菌 lmb 溶液作為陽性試驗。直接注射法：按規定，取上述批號的10a鹽酸地卡因注射液、1000鹽酸普魯卡因注射液，用無菌注射器直接取樣，分別接種到液體硫乙醇酸鹽培養基管（需氧培養基管、厭氧培養基管）和霉菌培養基管中，并作陽性對照管（同“薄膜過濾法”）進行培養、觀察和記錄。

3 方法與結果

3.1 試驗菌液的制備

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物引入培養液中，30-35℃培養16-18小時，用0.9%氯化鈉溶液溶解，得到兩位數的溶液，少計數的營養素，超過 100 攝氏度。將新鮮培養的氯化氯化藻放入液體巰基乙酸鹽中，30-35℃培養16-18h，使用0.9%醋酸氯溶液，氯化鈉溶液小于100cc/mL并在容器中計數。將新鮮培養的白色念珠菌加入改良馬提尼酒中，20-25℃放置48小時，使用0.將 9% 氯化鈉溶液稀釋至 100 cfu/ml 以下并用玫瑰珠計數。雙阿迪克鈉法）取新鮮培養的阿司匹林甘油加入改良的Martin Adaga梯度中，20-25℃培養7天，加入4ml 0.9%氯化鈉溶液，用氯化鈉溶液洗去氣泡。氯化物0.9%用小于 100 C/m2 的氯化鈉和雙馬丁等離子體。

3.2 培養基的靈敏度和無菌檢查

取 13 管巰基乙酸鹽，每管體積為 12 毫升，吸入 2 管金黃色葡萄球菌，培養3天，以每管9毫升的劑量服用9片馬丁片，并注射2片LBD bin和2片濃縮咖啡，每片小于100 cfu / ml。不是設計為不育控制的空控制器和 SD 培養。每天觀察結果，如果有細菌的培養基管生長良好，空對照管生長相同，則判斷培養基的敏感性和無菌性。

3.3 直接接種法

取供試品的H型管，用六種巰基乙酸鹽液制成供試品，其中一根注射管每米吸收50-100個葡萄球菌作為陽性試驗。輕輕搖動使供試品與培養基混合，將測試產品與容器混合。根據需要培養 14 天后，將適當數量的培養物轉移到培養基中，以恢復細菌培養（2 天、3 天），并觀察結果，結果如表1所示。

3.4 薄膜過濾法

將待測樣品用少量洗滌液浸濕至濾膜，加入待測樣品至內含一次性周圍細菌并排干。用流水沖洗，在 100 ml 試管中加入 100 ml 硫乙醇酸鹽液體培養基溶液。將 1 ml 金黃色葡萄球菌肉湯加入一個管中，然后將 100 ml 真菌培養基加入另一個在 30-35 度下孵育的管中。真菌在20-25°C的溫度下生長，14天后觀察結果，在此期間每天觀察細菌生長。取渦輪培養液轉入惰性液后，出現湍流，染色及鏡檢結果為無菌。分子過濾法 膜過濾法2個品種一次3次，共6個樣品在規定條件下培養7天，每天無細菌生長。陽性試管為（+），符合要求，應為無菌檢查合格。

3.5 口罩無菌檢測方法

在我國醫用口罩執行標準中，有GB19083-2010《醫用防護口罩技術要求》、YY0469-2011《醫用外科口罩》和YY/T0969-2013《一次性使用醫用口罩》。對此，需要理化指標檢測儀器、環氧乙烷殘留檢測儀器及微生物指標檢測儀器。在上述三個標準中，對于微生物指標檢測執行GB/T15979-2002《一次性使用衛生用品衛生標準》附錄B–產品微生物檢測方法和GB/T14233.2-2005《 醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法 第2部分：生物學試驗方法》第3章–無菌試驗。

B1 ?產品采集與樣品處理于同一批 號的 二個運輸包裝中至少抽取 12個蕞小銷售包裝樣品，1/4樣品用于檢測，1/4樣品用于留樣，另 1/2樣品（可就地封存）必要時用于復檢。抽樣的蕞小銷售包裝不應有破裂，檢驗前不得啟開。在100級凈化條件下用無菌方法打開用于檢測的至少 3個包裝，從每個包裝中取樣，準確稱取10g±1g樣品。剪碎后加人到200ml滅菌生理鹽水中，充分混勻，得到一個生理鹽水樣液。液體產品用原液直接做樣液。如被檢樣品含有大量吸水樹脂材料而導致不能吸出足夠樣液時，稀釋液量可按每次 50ml遞增，直至能吸出足夠測試用樣液。在計算細菌菌落總數與真菌菌落總數時相應調整稀釋度。

B2 ?細菌菌落總數與初始污染菌檢測方法

本方法適用于產品初始污染菌與細菌菌落總數（以下統稱為細菌菌落總數）檢測。

B2.1 操作步驟

待上述生理鹽水樣液自然沉降后取上清液作菌落計數。共接種 5個平皿，每個平皿中加人 1ml樣液，然后用冷卻至45℃左右的熔化的營養瓊脂培養基 15～20ml倒人每個平皿內混合均勻 。待瓊脂凝固后翻轉平皿置 35℃±2℃培養 48h后，計算平板上的菌落數。

B2.2 結果報告

菌落呈片狀生長的平板不宜采用;計數符合要求的平板上的菌落，按式（B1）計算結果：

X1=A×（K÷5）

式中X1—–細菌菌落總數 cfu/g或cfu/mL;

A——5塊營養瓊脂培養基平板上的細菌菌落總數;

K——稀釋度。

當菌落數在 100以內，按實有數報告，大于 100時采用二位有效數字。

如果樣品菌落總數超過本標準的規定，按 B2.3進行復檢和結果報告。

B2.3 復檢方法

將留存的復檢樣品依前法復測 2次，2次結果平均值都達到本標準的規定，則判定被檢樣品合格;其中有任何 1次結果平均值超過本標準規定，則判定被檢樣品不合格。

B3 ?大腸菌群檢測方法

B3.1 操作步驟

取樣液 5ml接種 50ml，乳糖膽鹽發酵管，置 35℃±2℃培養 24h，如不產酸也不產氣，則報告為大腸菌群陰性。如產酸產氣，則劃線接種伊紅美藍瓊脂平板，置35℃±2℃培養 18～24h，觀察平板上菌落形態。典型的大腸菌落為黑紫色或紅紫色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常具有金屬光澤，也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紅色，中心較深的菌落。

取疑似菌落 1-2個作革蘭氏染色鏡檢，同時接種乳糖發醉管，置 35℃±2℃培養 24h，觀察產氣情況。

B3.2 結果報告

凡乳糖膽鹽發酵骨產酸產氣，乳糖發酵管產酸產氣，在伊紅美藍平板上有典型大腸菌落，革蘭氏染色為陰性無芽胞桿菌，可報告被檢樣品檢出大腸桿菌。

B4 ?綠膿桿菌檢測方法

B4.1 操作步驟

取樣液 5ml，加人到50ml SCDLP培養液中，充分混勻，置 35℃±2℃培養 18～24h。如有綠膿桿菌生長，培養液農面呈現一層薄菌膜，培養液常呈黃綠色或藍綠色。從培養液的薄菌膜處挑取培養物，劃線接種十六烷三甲基溴化胺瓊脂平板，置 35℃±2℃ 培養 18～24h，觀察菌落特征。綠膿桿菌在此培養基上生長良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養基略帶粉紅色，其他菌不長。

取可疑菌落涂片作革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性菌者應進行下列試驗：

氧化酶試驗：取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內，用無菌玻棒挑取可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的 1%二甲基對苯二胺試液，30s內出現粉紅色或紫紅色，為氧化酶試驗陽性，不變色者為陰性。

綠膿菌素試驗：取2-3個可疑菌落，分別接種在綠膿菌素測定用培養基斜面，35℃±2℃培養24h，加入 3～5ml，充分振蕩使培養物中可能存在的綠膿菌素溶解，待三-氯-甲-烷呈藍色時，用吸管移到另一試管中并加人 1mol/L的鹽酸1mL，振蕩后靜置片刻。如上層出現粉紅色或紫紅色即為陽性，表示有綠膿菌素存在。

3.6 直接接種法

用上述條件下的6份檢品，經過7天的培養和觀察，栽培品種的栽培品種沒有生長。研究薄膜過濾法，分析是否符合規定，應足以控制無菌檢查合格。

4 結論

由表1可以看出，對同一試品采用直接接種法控制周期延長，采用膜過濾法縮短了控制周期并進行了優化。有的試品與培養基混合后會出現混亂，影響結果的判斷。薄膜過濾法可以克服直接嫁接法栽培延遲的缺點，特別是換種時缺乏增加污染的機會，本實驗證明，小容量注射劑也可以采用薄膜過濾法進行無菌檢查。

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