冠狀動脈疾病差異基因富集和加權基因共表達網絡分析

朱寶華, 孫 巖

(1. 山東省濟南市人民醫院 全科醫學科, 山東 濟南, 271100;2. 山東第一醫科大學附屬省立醫院 血管外科, 山東 濟南, 250021)

冠狀動脈疾病(CAD)是世界范圍內的首要死亡因素[1]。CAD的基本病理改變為動脈粥樣硬化，既往研究[2-3]證實脂質代謝和炎性反應參與了CAD的發病過程。應用抗血小板藥物和他汀類藥物對預防CAD誘發的不良事件有積極的作用[4], 但抗血小板治療的出血風險和他汀類藥物的肝毒性等副作用也在一定程度上影響了CAD的治療效果[5]。

隨著基因測序技術的成熟和成本的降低，基因組學在醫學領域的應用范圍逐漸擴大。相較于傳統研究思路的單一靶點或通路的驗證，以基因組學為基礎的生物信息學方法可以在短時間內獲取并分析海量的基因表達數據，深入挖掘疾病的潛在機制和核心通路[6]。美國國家生物技術信息中心(NCBI)的基因表達數據庫(GEO)是目前規模最大的疾病數據庫[7]。本研究采用生物信息學方法對GEO中CAD相關的基因數據集進行挖掘，篩選差異表達基因(DEGs)并進行功能富集分析，探討CAD發病的潛在靶點和機制，為CAD的診治提供理論依據，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 CAD的DEGs篩選

檢索NCBI的GEO, 獲取CAD基因表達芯片數據，下載GSE71226和GSE23561數據集。GSE71226數據集包含3例CAD患者和3例健康對照者外周血的基因表達數據，實驗平臺為GPL570 [HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array(美國昂飛)。GSE23561數據集包含9例健康對照者和6例CAD患者的外周血基因表達數據，實驗平臺為GPL10775 Human 50K Exonic Evidence-Based Oligonucleotide array(美國Microarrays)。采用R語言軟件中的“limma”數據包對GSE71226和GSE23561數據集進行歸一化處理，以P<0.05、|fold change|≥1.5為條件進行DEGs篩選和聚類分析，使用“ggord”“pheatmap”數據包將結果可視化。

1.2 CAD的DEGs富集分析

以P<0.05為條件，采用R語言“Cluster Profiler”數據包對篩選得到的CAD的DEGs進行信號通路富集分析，并將富集結果可視化。

1.3 CAD的DEGs功能聚類

采用基因集富集分析(GSEA)方法[8], 借助GSEA v4.1.0軟件分析CAD的DEGs數據，以歸一化富集得分絕對值>1、P<0.05、錯誤發現率(FDR)<0.25為條件來篩選CAD的DEGs相關的微小RNA(miRNA)，采用Cytoscape3.7.2軟件(http: //www. cytoscape.org)構建miRNA調控CAD的DEGs的網絡。

1.4 構建CAD的DEGs加權基因共表達網絡分析(WGCNA)

將數據上傳至WGCNA在線分析平臺iDEP (integrated differential expression and pathway analysis, http: //bioinformatics.sdstate.edu/idep/)[9], 采用加權矩陣模型將有相似表達模式的基因聚類，構建模塊與疾病表型相關性熱圖并篩選主要模塊的基因，構建蛋白質相互作用(PPI)網絡，以網絡節點度值為參考，采用Cytoscape 3.7.2軟件中的cytoHubba插件篩選PPI網絡中的核心靶點[10], 并進行內部驗證。

2 結 果

2.1 CAD的DEGs

經篩選，與健康對照者相比, CAD外周血基因表達存在顯著差異。共篩選獲得130個差異基因，其中上調基因62個，下調基因68個，見表1。經批次效應去除、數據標準化和聚類分析等操作后，繪制數據標準化后箱線圖、主成分分析(PCA)圖、差異基因表達火山圖和熱圖，見圖1。

表1 CAD的DEGs

2.2 CAD的DEGs富集分析

結果顯示, CAD上調基因顯著富集在Hippo、流體剪切力與動脈粥樣硬化、一磷酸腺苷依賴的蛋白激酶(AMPK)等信號通路上, CAD下調基因顯著富集在Wnt、核苷酸結合寡聚化結構域(NOD)樣受體和白細胞介素(IL)17等信號通路上，見圖2。

2.3 CAD的DEGs功能聚類

結果顯示, miR-503-3p、miR-3674、miR-5088-5p、miR-4486與CAD發病關系密切，可能是CAD相關的miRNA, 見圖3、4。

2.4 CAD的DEGs的WGCNA分析

WGCNA分析CAD的DEGs并構建鄰接矩陣，聚類分析后獲得10個模塊，分別為灰色、粉色、黑色、洋紅色、紅色、綠色、綠松石色、黃色、藍色、棕色，其中灰色模塊與CAD相關性低，見圖5。構建各模塊基因表達熱圖，可見各模塊中CAD組與健康組基因表達存在顯著差異，見圖6。構建模塊與疾病表型相關熱圖，分析發現洋紅色模塊與CAD發病關系最密切(相關系數=0.61,P=0.04), 見圖7。導出洋紅色模塊相關基因，采用Cytoscape3.7.2軟件構建PPI網絡，借助cytoHubba插件篩選PPI網絡中的核心靶點，結果表明,BMP4和C3是網絡中的核心靶點。統計2個數據集中BMP4和C3的表達量，結果顯示，與健康對照者相比, CAD患者C3表達升高,BMP4表達降低，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見圖8。

3 討 論

內皮細胞是CAD發生和發展的關鍵部位。內皮細胞的凋亡、血管新生、自噬等表型可直接參與動脈粥樣硬化發病[11]。Hippo信號通路可促進細胞死亡和分化，并抑制細胞增殖，也可響應細胞接觸、機械轉導等信號，參與動脈粥樣硬化發病。YES相關蛋白(YAP)和PDZ結合激活因子(TAZ)是內皮細胞功能調節的關鍵因子。研究[12]證實，冠狀動脈疾病相關的連接蛋白(JCAD)可負調節內皮細胞中的Hippo信號通路，介導YAP/TAZ活性以促進內皮功能障礙，參與動脈粥樣硬化發病。

血管內皮細胞可以根據來自血流的機械傳導力來辨識血流剖面的不同特征，并相應地調節血管生理和重塑，調整血管直徑，在分叉、彎曲等區域，動脈血流方向會發生復雜的改變，使得這些部位容易形成動脈粥樣硬化病變[13]。ZHOU H等[14]應用超聲粒子成像測速儀和流體力學測算等方法對3種狹窄程度的斑塊模型進行了血流動力學切應力分析，結果表明，管腔狹窄程度對流體剪切力的分布有顯著影響，斑塊剪切力較強的部位與斑塊破裂好發部位相同，提示流體剪切力可影響動脈粥樣硬化斑塊的穩定性。

AMPK是細胞能量代謝調節的關鍵激酶，可通過活化AMPK、抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mTORC1)、激活ATG1蛋白/ULK1/2激酶復合體的途徑啟動自噬，廣泛參與機體自噬調節過程。研究[15]顯示，丹皮酚可通過調控AMPK/mTOR信號通路而上調自噬反應，抑制血管平滑肌細胞增殖，發揮抗動脈粥樣硬化作用。除自噬外, AMPK還參與炎性反應。研究[16]顯示，苯溴馬

隆可調控AMPK/mTOR信號通路，降低體內尿酸水平，減少人血漿中IL-18的表達水平，抑制炎性反應，發揮抗動脈粥樣硬化作用。

Wnt5a是Wnt家族的一種分泌型糖蛋白。研究[17]表明，動脈粥樣硬化患者循環Wnt5a水平高于健康對照組。泡沫細胞是動脈粥樣硬化斑塊形成的關鍵因素之一。研究[18]表明，Wnt5a在晚期動脈粥樣硬化病變中顯著表達，誘導脂質攝取受體白細胞分化抗原36(CD36)的表達，加速了巨噬細胞中脂質的積累和泡沫細胞的形成，參與動脈粥樣硬化發病。

研究[19]表明，NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體與硫氧還蛋白-1協同作用可誘導糖尿病ApoE基因敲除小鼠模型血漿脂質和IL-1β表達升高，加速動脈粥樣硬化進程。研究[20]發現，低密度脂蛋白受體和NOD1/2雙基因敲除小鼠腸道膽固醇及其細菌降解產物糞甾醇升高，動脈粥樣硬化斑塊脂質沉積和炎性細胞浸潤減少，動脈粥樣硬化病變程度較輕，提示NOD信號通路可通過調節脂質代謝途徑參與動脈粥樣硬化發病。

IL-17是由輔助性T 細胞17產生的。DANZAKI K等[21]研究發現, IL-17可以誘導血管平滑肌細胞表達IL-6、重組人白介素8(CXCL8)和重組人白介素10(CXCL10)等促炎因子，參與動脈粥樣硬化的發病。研究[22]證實, IL-17A可通過抑制血管內皮黏附分子-1的表達發揮穩定小鼠動脈粥樣硬化斑塊的作用。此外, IL-17可以刺激血管平滑肌細胞合成膠原，較高水平的IL-17可以穩定頸動脈斑塊[23]。

在動脈粥樣硬化的發生發展過程中, miRNA參與調節炎癥反應、血管生成、發育和脂質代謝等諸多生物學過程，而miR-145是動脈粥樣硬化相關的miRNA，腫瘤壞死因子α通過下調血管平滑肌細胞中TET甲基胞嘧啶雙加氧酶2(TET2)的表達來抑制miR-145的表達，導致CD137/NFATc1信號的激活，并加劇小鼠的動脈粥樣硬化斑塊形成。研究[24]發現，在低密度脂蛋白受體基因敲除小鼠中, miR145水平降低可以減小動脈粥樣硬化斑塊的面積。在動脈粥樣硬化的發展過程中, miR-223可以調節血管平滑肌細胞和內皮細胞的脂質堆積[25-26]。此外, miRNA還可參與泡沫細胞形成、血管平滑肌細胞遷移等過程[27]。本研究采用GSEA分析發現, miR-503-3p、miR-3674、miR-5088-5p、miR-4486與CAD發病關系密切。

骨形態發生蛋白(BMP)與血管的生長發育關系密切。研究[28]報道, BMP-2、BMP-4、BMP-6和BMP-7可誘導血管生成、內皮細胞增殖和遷移。BMP4與動脈粥樣硬化的相關性尚未完全明確。研究[29]表明,BMP4及其受體BMPR2在晚期冠狀動脈粥樣硬化患者中的表達減少，在動物模型中對動脈粥樣硬化具有保護作用。研究[30]發現, 2型糖尿病患者血清BMP-4水平與收縮壓、甘油三酯、游離脂肪酸水平以及頸動脈內膜中層厚度呈負相關。本研究中，與健康對照者相比，CAD患者BMP4表達顯著降低，與上述研究結果相似。研究[31]還證實，缺氧時內皮細胞可表達BMP4, 并促進血管平滑肌細胞增殖，這表明BMP對血管平滑肌細胞的影響取決于組織和微環境，其與CAD的相關性有待進一步確認。

補體系統是人類抵御病原體的復雜蛋白質網絡。補體C3主要由巨噬細胞和肝臟合成，是心血管疾病的危險因素。補體C3a與頸動脈內膜中層厚度呈正相關, C3、C3a與冠狀動脈疾病密切相關[32]。研究[33]表明，在ApoE基因敲除小鼠模型中, C3、C4與外膜中的膠原蛋白和彈性纖維均廣泛結合，血管周圍脂肪組織中也存在C3、C4, 表明補體C3、C4可通過共價硫酯鍵與外膜中的膠原蛋白和彈性蛋白纖維結合，導致血管僵硬，參與動脈粥樣硬化。本研究中，與健康對照者相比, CAD患者C3表達顯著升高，與上述結果相似。

綜上所述, CAD發病過程中基因表達存在顯著差異，其病理過程與Hippo、流體剪切力與動脈粥樣硬化、AMPK、Wnt、NOD樣受體和IL-17等信號通路相關。CAD病理過程可能受到miR-503-3p、miR-3674、miR-5088-5p、miR-4486等miRNA調控,BMP4和C3可能是CAD發病的關鍵基因。