長鏈非編碼RNA腫瘤易感候選基因11在卵巢癌組織中的表達及意義

萬淑瓊, 劉佳棟, 陳靜青, 謝 環

(1. 鄂東醫療集團黃石市中心醫院, 湖北 黃石, 435200;2. 湖北省宜昌市第二人民醫院/三峽大學第二人民醫院 婦科, 湖北 宜昌, 443000)

卵巢癌是女性生殖系統高發惡性腫瘤之一，早期癥狀較為隱匿，且侵襲力強、進展迅速[1], 雖然卵巢癌的診療手段近年來不斷發展，但治療后仍易復發，導致患者病死率較高，長期預后依然不佳[2]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度在200個核苷酸以上且缺失或具有少量編碼蛋白能力的非編碼RNA, 可通過調控基因表達而在細胞增殖、生長、分化、代謝等多種生理過程中發揮重要作用[3], 參與多種疾病的發生過程[4], 同時與多種惡性腫瘤的發生、進展過程密切相關[5]。腫瘤易感候選基因11(CASC11)作為新近發現的一種lncRNA, 在小細胞肺癌組織中表達異常且與預后有一定關系[6], 但其是否參與卵巢癌的發生與進展過程尚鮮有報道。本研究分析了卵巢癌組織中CASC11表達情況及其與不同臨床病理指標的關系，并通過小干擾RNA(siRNA)技術抑制SKOV3細胞中CASC11表達，觀察其對細胞生物學功能的影響，以期為卵巢癌的機制研究及早期診療提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月—2019年12月在鄂東醫療集團黃石市中心醫院婦科接受手術治療的104例卵巢癌患者作為研究對象，患者術前均未行放化療治療，且術后病理確診為卵巢上皮性癌。患者年齡30～75歲，平均(49.38±10.37)歲; 組織學類型為漿液性61例，其他43例; 分化程度為中高分化67例，低分化37例; 國際婦產科聯盟(FIGO)分期為Ⅰ～Ⅱ期48例, Ⅲ～Ⅳ期56例; 發生淋巴結轉移者48例。術中留取卵巢癌組織以及癌旁>2 cm正常癌旁組織，快速置于液氮中, -80 ℃保存。本研究經醫院倫理委員會審核批準，且所有患者均對研究知情同意。

1.2 主要試劑和設備

總RNA試劑(Trizol法)和Lipofectamine 2 000轉染試劑購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒和聚合酶鏈反應(PCR)擴增試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司, CASC11和內參引物由上海斯信生物科技有限公司設計合成, SKOV3細胞購自上海通派生物科技有限公司，達氏修正依氏培養基(DMEM)/F12培養液購自美國Sigma公司，胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司, CASC11干擾序列和陰性對照序列由上海吉凱基因化學技術有限公司設計合成，噻唑藍(MTT)購自廣東翁江化學試劑有限公司，二甲基亞砜(DMSO)購自上海一研生物科技有限公司, Matrigel基質膠購自美國BD公司, Transwell小室購自美國Corning公司, CFX-96實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量PCR法檢測組織中CASC11表達情況: 取卵巢癌組織和癌旁正常組織，剪碎、研磨，按試劑盒說明提取總RNA并檢測純度，合格標準為A260/A280≥1.80。將總RNA逆轉錄為cDNA, 使用實時熒光定量PCR儀參照PCR擴增試劑盒說明對引物進行擴增。CASC11上游引物5′-GGTCCGAAGAAAGAGGAGTTAC-3′, 下游引物5′-TTTGTGTCTCGGTTCTCCATAG-3′; U6上游引物5′-CAGAGCTCCTCGTCTTGCC-3′, 下游引物5′-GTCGCCACCATGAGAGAC-3′。反應條件為94 ℃ 2 min, 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 75 ℃ 30 s, 連續36個循環。采用2-△△Ct法計算CASC11相對表達量。

1.3.2 細胞培養和分組: 應用含5% CO2的37 ℃培養箱對SKOV3細胞進行培養，胰酶消化對數生長期細胞，接種于6孔板, 2×105個/孔。將細胞分成3組，用Lipofectamine 2 000轉染試劑分別對3組細胞進行轉染。① si-CASC11組，轉染CASC11基因的干擾序列為5′-GGAACTCACCAGCCAAGTT-3′; ② 陰性對照組，轉染陰性對照序列為5′-CAGCGCTGACAACAGTTTCAT-3′; ③ 空白組，僅加入轉染試劑，不進行其他處理。3組均繼續培養48 h。

1.3.3 實時熒光定量PCR法檢測細胞中CASC11表達情況: 各組細胞于轉染后培養48 h時，胰酶消化，離心，取細胞沉淀，加入細胞裂解液，其余步驟同1.3.1。

1.3.4 MTT法檢測細胞增殖情況: 取各組細胞，胰酶消化，接種于96孔板，密度為2×103個/孔，分別于培養12、24、48、72、96 h時，將MTT液20 μL加入各孔，培養4 h, 將上清去除，各孔加入DMSO液150 μL, 充分振蕩20 min, 應用酶標儀取450 nm波長對各孔吸光度(A)值進行檢測。重復實驗3次[7]。

1.3.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力: 各組細胞于轉染后培養48 h時，胰酶消化，接種于6孔板，密度為5×105個/孔，過夜培養，用200 μL移液槍槍頭垂直于孔板劃橫線，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，用不含血清培養液培養24 h或48 h，觀察并測量細胞遷移距離，計算細胞劃痕愈合率，公式為細胞劃痕愈合率=(初始劃痕寬度-24 h或48 h劃痕寬度)/初始劃痕寬度×100%[8]。

1.3.6 Transwell法檢測細胞侵襲能力: 用不含胎牛血清培養液稀釋基質膠，平鋪在小室上室，過夜風干。各組細胞行胰酶消化，離心，用不含血清培養液重懸，密度5×105個/mL, 取200 μL加入上室，將含20%胎牛血清培養液600 μL加入下室，培養24 h, 將小室取出，多聚甲醛固定, 0.1%結晶紫染色, PBS沖洗3次，用棉簽除去散落細胞，鏡下觀察，計數穿膜細胞數。重復實驗3次[9-10]。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 卵巢癌組織和癌旁正常組織中CASC11表達情況比較

卵巢癌組織中CASC11相對表達量為(1.89±0.14), 高于癌旁組織的(1.00±0.07), 差異有統計學意義(t=57.272,P<0.001)。

2.2 卵巢癌組織中CASC11表達與臨床病理指標的關系

卵巢癌組織中CASC11相對表達量在不同年齡、組織學類型和腹腔積液差異無統計學意義(P>0.05), 而在不同分化程度、FIGO分期和淋巴結轉移差異有統計學意義(P<0.05), 見表1。

表1 卵巢癌組織中CASC11表達與臨床病理指標間的關系

2.3 轉染si-CASC11對細胞中CASC11表達的影響

實時熒光定量PCR結果顯示, si-CASC11組、陰性對照組和空白組細胞中CASC11相對表達量分別為(0.22±0.11)、(0.98±0.06)和(1.02±0.12)。si-CASC11組細胞中CASC11相對表達量低于陰性對照組和空白組，差異有統計學意義(P<0.001), 表明si-CASC11轉染能夠顯著抑制SKOV3細胞中CASC11的表達。見圖1。

2.4 抑制CASC11對SKOV3細胞增殖活性的影響

MTT法檢測結果顯示，培養24、48、72、96 h時, si-CASC11組A值均低于空白組、陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05); 培養12 h時, 3組A值比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組細胞不同時點吸光度值比較

2.5 抑制CASC11對SKOV3細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結果顯示, si-CASC11組24、48 h時的細胞劃痕愈合率均低于陰性對照組、空白組，差異有統計學意義(P<0.05), 表明抑制CASC11表達能夠顯著抑制SKOV3細胞的遷移能力。見表3、圖2。

表3 3組細胞劃痕愈合率比較 %

2.6 抑制CASC11對SKOV3細胞侵襲能力的影響

si-CASC11組侵襲細胞數為(85.67±6.47)個，低于陰性對照組的(121.17±6.65)個和空白組的(124.50±5.65)個，差異有統計學意義(P<0.01), 表明抑制CASC11表達能夠顯著抑制SKOV3細胞的遷移能力。見圖3。

3 討 論

卵巢癌是女性高發惡性腫瘤之一，病死率高，其發病機制復雜，涉及眾多遺傳及環境因素，至今尚未完全闡明。多項研究[11-12]提示，卵巢癌細胞惡性增殖及高侵襲轉移性與患者預后差密切相關。因此，積極尋找與卵巢癌生長及侵襲轉移相關的關鍵性基因有望為卵巢癌的精準診療及預后改善提供新的方向。近年來, lncRNA在腫瘤發生、進展中的作用越來越被重視，多種lncRNA參與了卵巢癌進程[13], 且與卵巢癌預后關系密切[14]。CASC11是新近發現的一種lncRNA, 位于人染色體8q24.21,參與人體多種疾病的發生過程[15], 且在肝癌[16]、骨肉瘤[17]等多種惡性腫瘤組織中呈高表達，其可能參與了惡性腫瘤的發生、發展過程。本研究結果顯示，卵巢癌組織中CASC11相對表達量高于癌旁正常組織，說明CASC11在卵巢癌組織中呈高表達，可能參與了卵巢癌發生過程。本研究還發現, CASC11在低分化、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期和發生淋巴結轉移的卵巢癌組織中相對表達量明顯更高，進一步說明CASC11可能在卵巢癌進展中發揮重要作用。

為進一步明確CASC11在卵巢癌細胞增殖及侵襲轉移中的作用，本研究采用轉染干擾序列的方法特異性抑制卵巢癌SKOV3細胞中CASC11的表達，發現si-CASC11細胞中CASC11相對表達量相較于陰性對照組和空白組顯著降低，說明SKOV3細胞中CASC11表達被成功抑制。相關研究[18]指出, CASC11通過阻斷胃癌細胞周期，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。研究[19]指出, CASC11通過miRNA-150促進膀胱癌細胞增殖。本研究結果顯示，抑制CASC11表達可抑制SKOV3細胞增殖，提示CASC11可能參與了SKOV3細胞的增殖過程。相關研究[20]指出, CASC11通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進宮頸癌細胞的遷移和侵襲。SU X H等[21]指出, lncRNA CASC11可促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究結果提示，抑制CASC11表達可抑制SKOV3細胞遷移和侵襲力，提示CASC11可能參與了卵巢癌遷移和侵襲過程。

綜上所述，卵巢癌組織中CASC11呈高表達，且與惡性進展的臨床病理指標有關，抑制CASC11表達可抑制SKOV3細胞增殖、遷移和侵襲力，但其具體作用機制尚待進一步深入研究加以明確。