下調LncRNA KCNQ1OT1對喉癌Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化的影響*

徐輝聰 林振群 林智 吳育芝 熊俊成

(1.海口市第三人民醫院耳鼻喉科,海南 海口 571100；2.海南省人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科,海南 海口 570311；3.海南醫學院基礎醫學與生命科學學院，海南 海口 571199)

喉癌是頭頸部比較常見的惡性腫瘤，患者主要有聲嘶、呼吸困難、咳嗽、吞咽困難、頸部淋巴結轉移等癥狀[1]。近年來，喉癌患者通過手術、放射化療及生物治療等方式進行治療，5年生存率得以提高。復發和轉移是影響預后的主要因素，轉移淋巴結數量越多，體積越大，5年生存率越低[2]。因此深入研究喉癌發生發展的分子機制能為患者的早期診斷和晚期預后提供理論基礎。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一類轉錄本長度超過200個核苷酸的RNA分子，不具有蛋白質編碼功能。研究發現lncRNA參與基因表達的表觀遺傳調控、轉錄調控和轉錄后調控[3-4]，還參與細胞生長、分化、凋亡等多種生物學過程[5]。有文獻報道LncRNA KCNQ1OT1(KCNQ1OT1)在癌細胞中異常表達并參與了多種癌癥的進展。如KCNQ1OT1在卵巢癌、結直腸癌細胞中過表達，并通過miR-217/ZEB1反饋回路促進了結直腸癌的遷移和上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[6-7]。另有研究顯示，KCNQ1OT1在鼻咽癌組織和細胞中呈低表達,過表達KCNQ1OT1可通過增加SEMA3B基因的表達,抑制鼻咽癌細胞的增殖和遷移[8]。然而，KCNQ1OT1在喉癌發展過程中的表達及作用機制尚不清楚。因此，本研究擬探究KCNQ1OT1在喉癌發展過程中的作用，為進一步闡明喉癌的進展機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料 喉癌細胞Hep-2和正常喉上皮細胞HLEC購自北京清源浩生物科技有限公司；DMEM(Dulbecco's-modified Eagle′s medium)培養基、胎牛血清(FBS)購于美國Gibco公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購于大連Takara公司；Goat anti-Rabbit IgG (H+L)-HRP、Goat anti-Mouse IgG (H+L)-HRP、E-cadherin、N-cadherin抗體購自美國圣克魯斯生物科技有限公司；FAK、Src、MAPK、GAPDH抗體購自美國Abcam公司；FAK通路抑制劑Y15購自美國MCE公司；siRNA NC、KCNQ1OT1 siRNA、pcDNA-KCNQ1OT1、mimics NC、miR-138 mimics、inhibitor NC、miR-138 inhibitor質粒由北京擎科生物有限公司合成；點突變試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒為中國賽默飛世爾科技公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 在含10% FBS的DMEM培養基中培養Hep-2細胞和HLEC細胞，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，細胞長滿后，將細胞按相應密度接種于6孔板或12孔板中，用于后續試驗。

1.2.2 細胞轉染 取對數生長且狀態良好的細胞，用胰酶消化，用含10% FBS的DMEM重懸細胞后，按照按1×105個/孔的密度鋪于12孔板中，細胞密度匯合達65%時，更換細胞培養液為新鮮DMEM，細胞按轉染質粒不同分組為：①siRNA NC組(轉染50 nmol/L的陰性對照質粒)、KCNQ1OT1 siRNA組(轉染50 nmol/L的KCNQ1OT1 siRNA質粒)。②Control組、Y15組(作用10 μmol/L的Y15)、inhibitor NC組(轉染50 nmol/L的抑制劑對照組)、miR-138 inhibitor組(轉染50 nmol/L的miR-138抑制劑)、miR-138 inhibitor+Y15組(轉染50 nmol/L的miR-138抑制劑+10μmol/L的Y15)。③mimics NC組(轉染50 nmol/L的模擬物對照)、miR-138 mimics組(轉染50 nmol/L的miR-138模擬物)。④KCNQ1OT1 wt+mimics NC組(轉染50 nmol/L的KCNQ1OT1野生型質粒+50 nmol/L的模擬物對照)、KCNQ1OT1 wt+miR-138 mimics組(轉染50 nmol/L的KCNQ1OT1野生型質粒+50 nmol/L的miR-138模擬物)、KCNQ1OT1 mut+mimics NC組(轉染50 nmol/L的KCNQ1OT1突變型質粒+50 nmol/L的模擬物對照)、KCNQ1OT1 mut+miR-138 mimics組(轉染50 nmol/L的KCNQ1OT1突變型質粒+50 nmol/L的miR-138模擬物)。⑤pcDNA-3.1(+)+mimics NC組(轉染50 nmol/L的pcDNA-3.1(+)質粒+50 nmol/L的模擬物對照)、pcDNA-KCNQ1OT1+mimics NC組(轉染50 nmol/L的pcDNA-KCNQ1OT1質粒+50 nmol/L的模擬物對照)、miR-138 mimics+pcDNA-3.1(+)組(轉染50 nmol/L的miR-138模擬物+50 nmol/L的pcDNA-3.1(+)質粒)、pcDNA-KCNQ1OT1+miR-138 mimics組(轉染50 nmol/L的pcDNA-KCNQ1OT1質粒+50 nmol/L的miR-138模擬物)。⑥FAK wt+mimics NC組(轉染50 nmol/L的FAK野生型質粒+50 nmol/L的模擬物對照)、FAK wt+miR-138 mimics組(轉染50 nmol/L的FAK野生型質粒+50 nmol/L的miR-138模擬物)、FAK mut+mimics NC組(轉染50 nmol/L的FAK突變型質粒+50 nmol/L的模擬物對照)、FAK mut+miR-138 mimics組(轉染50 nmol/L的FAK突變型質粒+50 nmol/L的miR-138模擬物)。采用Tubfect轉染試劑轉染各組質粒，在37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養48 h后收集各組細胞RNA樣和蛋白樣進行后續檢測。

1.2.3 細胞增殖測定 取對數生長且狀態良好的細胞，當細胞密度達95%時，用含10% FBS DMEM培養基重懸細胞，根據1×105個/mL的密度鋪于96孔板中，細胞長到70%～80%時，采用Tubfect試劑轉染質粒，每組重復8個，培養不同時間點后棄上清，PBS洗2次，每孔加10 μL CCK-8工作液，孵育4 h，使用酶標儀上讀取各孔在450 nm處的吸光值(OD)，并計算細胞活性。

1.2.4 細胞侵襲實驗 將-20 ℃保存的matrigel取出，放在4 ℃條件下融化，用無FBS DMEM培養基稀釋matrigel，使濃度為1 mg/mL，添加100 μL稀釋后的matrigel于每個上室中，繼續孵育5 h凝成膠狀。細胞長滿后，PBS洗兩次，使用胰酶消化，用無FBS的DMEM培養基重懸細胞，將細胞懸液調整密度為5×105/mL，加入適量細胞懸液于Transwell小室中，下室中為10% FBS的DMEM，37 ℃、5% CO2培養箱繼續培養36 h后，取出小室，PBS洗2次，多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色15 min，隨機選取5個視野細胞放在顯微鏡下觀察并記數。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因活性檢測 用miRanda和TargetScan分別預測KCNQ1OT1和FAK潛在靶基因，PCR擴增KCNQ1OT1 3′UTR片段及FAK 3′UTR片段，構建KCNQ1OT1 wt和FAK wt載體，再使用點突變試劑盒構建KCNQ1OT1和FAK突變體。使用Tubfect試劑轉染各組重組質粒，通過雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測細胞的熒光素酶活性。

1.2.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 采用Trizol試劑從細胞中提取總RNA，測定RNA濃度及純度后，采用Takara反轉錄試劑盒將RNA反轉成cDNA，按照42 ℃，2 min；37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s的程序進行，反轉錄得到的cDNA為模板，進行RT-qPCR，實驗結果使用2-ΔΔCt法進行分析。

1.2.7 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測 按實驗要求培養細胞一定時間后，將收取的蛋白樣中加入RIPA裂解液，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，點樣后進行SDS-PAGE凝膠電泳，按照80 V 30 min、110 V 2 h的程序進行，結束電泳后使用濕轉儀器轉移蛋白到PVDF膜上。結束轉膜后，PVDF膜與50 g/L脫脂奶粉配制的封閉液在室溫共孵育2 h，孵育結束后PVDF膜與特異性一抗(Ecadherin 1∶200、Ncadherin 1∶200、FAK 1∶1000、p-FAK 1∶2000、Src 1∶1500、p-Src 1∶2000、MAPK 1∶1000、p-MAPK 1∶1500、GAPDH 1∶3000)在4 ℃過夜孵育，TBST洗5次，PVDF膜與相應二抗在室溫孵育2 h，TBST洗5次，每次5min，滴加ECL反應液后即可進行目的蛋白曝光。分析LncRNA KCNQ1OT1通過miR-138對Hep-2細胞內EMT相關蛋白Ecadherin、Ncadherin表達及其FAk/Src/MAPK通路的影響。

1.3 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行數據統計分析，至少取3次獨立實驗結果。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 沉默KCNQ1OT1抑制Hep-2細胞的增殖、侵襲和EMT Hep-2細胞中KCNQ1OT1的表達量明顯高于HLEC細胞(P<0.01)(圖1A)；與siRNA NC組相比，KCNQ1OT1 siRNA組的KCNQ1OT1表達量明顯降低(P<0.01)(圖1B)；KCNQ1OT1 siRNA組的細胞增殖能力低于siRNA NC組(P<0.05)(圖1C)；KCNQ1OT1 siRNA組細胞的侵襲數目明顯低于siRNA NC組(P<0.01)(圖1D、1E)；與siRNA NC組相比，KCNQ1OT1 siRNA組E-cadherin蛋白表達量明顯上升(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達量明顯下降(P<0.01)(圖1F、1G)。結果表明沉默KCNQ1OT1能夠抑制Hep-2細胞的增殖、侵襲和EMT。

圖1 沉默KCNQ1OT1抑制Hep-2細胞的增殖、侵襲和EMT(n=3)Figure 1 Silencing KCNQ1OT1 inhibited the proliferation,invasion and EMT of Hep-2 cells注：A.RT-qPCR檢測KCNQ1OT1在Hep-2和HLEC細胞中的表達量；B.RT-qPCR檢測干擾KCNQ1OT1后細胞中的KCNQ1OT1的表達量；C.CCK-8檢測KCNQ1OT1對Hep-2細胞增殖的影響；D.細胞侵襲實驗檢測KCNQ1OT1對Hep-2細胞侵襲的影響；E.Hep-2細胞的侵襲數目；F.Western blot檢測KCNQ1OT1對Hep-2細胞EMT的影響；G.E-cadherin、N-cadherin蛋白的相對表達量。兩組比較，①P<0.05;②P<0.01

2.2 KCNQ1OT1和miR-138之間的靶向和調控關系 miRanda預測KCNQ1OT1和miR-138之間的結合位點(圖2A)。當質粒攜帶KCNQ1OT1 3′UTR wt時，miR-138的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01),當質粒攜帶KCNQ1OT1 3′UTR mut時，miR-138的熒光素酶活性無變化(P>0.05)(圖2B)。與siRNA NC組相比，KCNQ1OT1 siRNA組miR-138的表達量明顯上升(P<0.01)(圖2C)。結果表明KCNQ1OT1和miR-138之間存在負調控關系。

圖2 KCNQ1OT1和miR-138之間的靶向和調控關系(n=3)Figure 2 Targeting and regulatory relationship between KCNQ1OT1 and miR-138注：A.miRanda預測KCNQ1OT1和miR-138之間的結合位點；B.熒光素酶表達量的定；C.RT-qPCR檢測miR-138的表達量。兩組比較，①P<0.01

2.3 沉默miR-138促進Hep-2細胞的增殖、侵襲和EMT Hep-2細胞中miR-138的表達量明顯低于HLEC細胞(P<0.01)(圖3A)。和inhibitor NC組相比，miR-138 inhibitor組的miR-138表達量明顯下降(P<0.01)(圖3B)。miR-138 inhibitor組的細胞增殖能力高于inhibitor NC組(P<0.05)(圖3C)。miR-138 inhibitor組細胞的侵襲數目明顯高于inhibitor NC組(P<0.01)(圖3D、3E)。和inhibitor NC組相比，miR-138 inhibitor組的E-cadherin蛋白表達量下降(P<0.05)，N-cadherin蛋白表達量明顯上升(P<0.01)(圖3F、3G)。結果表明沉默miR-138能夠促進Hep-2細胞的增殖、侵襲和EMT。

圖3 沉默miR-138促進Hep-2細胞的增殖、侵襲和EMT(n=3)Figure 3 Silencing miR-138 promoted the proliferation,invasion and EMT of Hep-2 cells注：A.RT-qPCR檢測miR-138在Hep-2和HLEC細胞中的表達量；B.RT-qPCR檢測干擾miR-138后細胞中miR-138的表達量；C.CCK-8檢測miR-138對Hep-2細胞增殖的影響；D.細胞侵襲實驗檢測miR-138對Hep-2細胞侵襲的影響；E.Hep-2細胞的侵襲數目；F.Western blot檢測 miR-138對Hep-2細胞EMT的影響；G.E-cadherin、N-cadherin蛋白的相對表達量。兩組比較，①P<0.05;②P<0.01

2.4 KCNQ1OT1通過miR-138調控Hep-2細胞的增殖、侵襲和EMT 與mimics NC組相比，miR-138 mimics組miR-138的表達量明顯增加(P<0.01)(圖4A)。與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNA-KCNQ1OT1+mimics NC組細胞增殖能力增加(P<0.05)，細胞侵襲數目明顯增加(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達量明顯下降(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達量明顯上升(P<0.01)；與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，miR-138 mimics+pcDNA-3.1(+)組的細胞增殖能力下降(P<0.05)，細胞侵襲數目減少(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達量明顯上升(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達量明顯下降(P<0.01)；與miR-138 mimics+pcDNA-3.1(+)組相比，pcDNA-KCNQ1OT1+miR-138 mimics組的細胞增殖能力上升(P<0.05)，細胞侵襲數目增加(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達量明顯下降(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達量明顯上升(P<0.01)(圖4B～4G)。結果表明KCNQ1OT1通過miR-138調控Hep-2細胞增殖、侵襲和EMT。

圖4 KCNQ1OT1通過miR-138調控Hep-2細胞的增殖、侵襲和EMT(n=3)Figure 4 KCNQ1OT1 regulated the proliferation,invasion and EMT of Hep-2 cells through miR-138注：A.RT-qPCR檢測過表達miR-138后細胞中的miR-138表達量；B.CCK-8檢測KCNQ1OT1通過miR-138對Hep-2細胞增殖的影響；C.細胞侵襲實驗檢測KCNQ1OT1通過miR-138對Hep-2細胞侵襲的影響；D.Hep-2細胞的侵襲數目；E.Western blot檢測KCNQ1OT1通過miR-138對Hep-2細胞EMT的影響；F.E-cadherin、N-cadherin蛋白的相對表達量。兩組比較，①P<0.05;②P<0.01

2.5 miR-138和FAK之間的靶向和調控關系 預測miR-138和FAK之間的結合位點(圖5A)。當質粒攜帶FAK 3′UTR wt時，miR-138的熒光素酶活性下降(P<0.01)；當質粒攜帶FAK 3′UTR mut時，miR-138的熒光素酶活性無變化(P>0.05)(圖5B)。與inhibitor NC相比，miR-138 inhibitor促進FAK的基因表達(圖5C)。結果表明FAK和miR-138之間存在負調控關系。

圖5 miR-138和FAK之間的靶向和調控關系(n=3)Figure 5 Targeting and regulatory relationships between miR-138 and FAK注：A.TargetScan預測miR-138和FAK之間的結合位點；B.熒光素酶表達量的測定；C.RT-qPCR檢測FAK的表達量。兩組比較，①P<0.01

2.6 沉默miR-138激活Hep-2細胞中FAK/Src/MAPK信號通路 與inhibitor NC組相比，miR-138 inhibitor組FAK、Src、MAPK蛋白的磷酸化水平升高，p-FAK/FAK、p-Src/Src和p-MAPK/MAPK比值升高(P<0.01)；與mimics NC組相比，miR-138 mimics組FAK、Src、MAPK蛋白的磷酸化水平下降，p-FAK/FAK、p-Src/Src和p-MAPK/MAPK比值降低(P<0.01)。結果表明沉默miR-138能夠激活Hep-2細胞中FAK/Src/MAPK信號通路。見圖6。

圖6 沉默miR-138激活Hep-2細胞中FAK/Src/MAPK信號通路(n=3)Figure 6 Silencing miR-138 activated the FAK/Src/MAPK signaling pathway in Hep-2 cells注：A.Western blot檢測過表達及干擾miR-138后Hep-2細胞中FAK、Src、MAPK蛋白磷酸化水平；B.p-FAK/FAK、p-Src/Src和p-MAPK/MAPK比值。兩組比較，①P<0.01

2.7 沉默miR-138激活FAK/Src/MAPK信號通路促進Hep-2細胞增殖、侵襲和EMT 和inhibitor NC組相比，miR-138 inhibitor組的細胞增殖能力升高(P<0.05)，侵襲數目明顯增加(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達量明顯下降(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達量明顯上升(P<0.01)；和Control組相比，Y15組的細胞增殖能力明顯下降(P<0.01)，侵襲數目明顯減少(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達量明顯升高(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達量明顯下降(P<0.01)；和miR-138 inhibitor組相比，miR-138 inhibitor+Y15組的細胞增殖能力下降(P<0.01)，侵襲數目明顯減少(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達量明顯升高(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達量明顯下降(P<0.01)。結果表明沉默miR-138激活FAK/Src/MAPK信號通路促進Hep-2細胞增殖、侵襲和EMT。見圖7。

圖7 沉默miR-138激活FAK/Src/MAPK信號通路促進Hep-2細胞增殖、侵襲和EMT(n=3)Figure 7 Silencing miR-138 activated the FAK/Src/MAPK signaling pathway to promote proliferation,invasion and EMT of Hep-2 cells注：A.CCK-8法檢測沉默miR-138激活FAK/Src/MAPK通路對Hep-2細胞增殖的影響；B.細胞侵襲實驗檢測沉默miR-138激活FAK/Src/MAPK通路對Hep-2細胞侵襲的影響；C.Hep-2細胞的侵襲數目；D.Western blot檢測沉默miR-138激活FAK/Src/MAPK通路對Hep-2細胞EMT的影響；E.E-cadherin、N-cadherin蛋白的相對表達量。兩組比較，①P<0.05;②P<0.01

3 討論

lncRNA介導的表觀遺傳調控轉錄在多生物學功能中發揮重要的作用。研究表明，lncRNA通過與染色質相互作用，從遺傳學上調節染色體域的多個基因的轉錄。lncRNA KCNQ1OT1作為一種印跡基因，是一種與染色質相互作用的長鏈非編碼RNA。近年來，越來越多的證據表明lncRNA KCNQ1OT1的異常表達可能作為癌基因或抑癌基因，參與癌癥的發生發展，可作為癌癥的診斷和預后標志物。例如，lncRNA KCNQ1OT1通過miR-211-5p介導的Ezrin/Fak/Src信號通路調控舌癌細胞增殖和順鉑耐藥[9]；異常表達的lncRNA KCNQ1OT1是診斷早期胃癌的生物標志物[10]；lncRNA KCNQ1OT1在NSCLC組織中高表達，與患者的預后相關，可作為潛在的肺癌預后預測分子標志物[11]。有文獻報道lncRNA KCNQ1OT1通過靶向miR-34a/ATG4B途徑增強奧沙利鉑在結腸癌中的耐藥[12]。本研究發現與正常細胞相比，KCNQ1OT1在喉癌細胞中表達上調，KCNQ1OT1的異常表達提示分子與喉癌發展密切相關，這與KCNQ1OT1在舌癌、結直腸癌和肺癌中的研究結果一致。另外本研究發現干擾KCNQ1OT1的表達抑制了Hep-2細胞的增殖、侵襲和EMT進程，表明KCNQ1OT1能夠作為癌基因在喉癌發展過程中發揮作用。

lncRNA作為競爭內源性RNA或miRNA海綿，參與調控多種細胞生物學活動[13-14]。本研究探討了lncRNA KCNQ1OT1是否通過與miRNA相互作用而發揮功能。通過生物學信息軟件預測和雙熒光素酶報告基因實驗分析發現KCNQ1OT1和miR-138具有靶向和負調控關系。有研究表明miR-138參與各種癌癥的發生發展。miR-138可直接靶向FAK激酶，抑制細胞侵襲，增加癌細胞對化療的敏感性[15]，在前列腺癌中可以通過CTNNB1的轉錄誘導間接上調AMACR表達[16]，通過靶向PI3K/AKT自噬信號通路中的PDK1抑制惡性黑色素瘤發展[17]，可抑制人SGC-7901細胞的增殖能力,機制可能是通過抑制靶基因hTERT蛋白的表達[18]，上調miR-138表達可抑制腦膠質瘤細胞侵襲轉移，可能與負向調節Sema4C表達有關[19]。考慮到miR-138在各種癌癥發展過程中的關鍵作用，本研究深入探討miR-138在喉癌中的臨床意義，發現miR-138在喉癌細胞中的表達明顯低于正常細胞。本研究將miR-138干擾質粒轉染至Hep-2細胞后，發現Hep-2細胞增殖能力升高，侵襲數目明顯增加，E-cadherin蛋白表達量下降，N-cadherin蛋白表達量明顯上升，而過表達miR-138后，明顯抑制了Hep-2細胞的增殖、侵襲和EMT，這與miR-138在腎細胞癌、鼻咽癌、膽囊癌等多種癌癥中發揮的作用一致，說明在Hep-2細胞發展過程中，miR-138發揮了明顯的抑癌功能。此外還發現KCNQ1OT1能夠通過miR-138促進喉癌的增殖、侵襲和EMT，沉默miR-138通過激活FAK/Src/MAPK通路促進癌細胞增殖、侵襲和EMT，提示我們FAK/Src/MAPK通路可能是喉癌患者靶向治療的一個新方向，值得進一步深入探討。

4 結論

下調LncRNA KCNQ1OT1通過miR-138/FAK/Src/MAPK軸可抑制喉癌Hep-2細胞的增殖、侵襲和EMT。本研究結果為進一步了解喉癌發展的分子機制提供了理論基礎，同時也為喉癌患者的臨床診斷和治療提供了試驗依據。