基于改良QuEChERS-氣相色譜-串聯質譜法測定禽蛋中53 種農藥殘留

梁秀美, 張 井, 林定鵬, 何如意, 謝拾冰,廖琳慧, 王 亮, 徐 靜, 張維一*,

(1. 浙江省溫州市農業科學研究院，農業農村部農產品質量安全風險評估實驗站，浙江 溫州 325006；2. 浙江省麗水市蓮都區農業技術推廣中心，浙江 麗水 323000)

中國是禽蛋生產和消費大國，禽蛋具有較高的營養價值，其質量安全直接關系到消費者的身體健康和國家經濟利益[1]。但養殖場在養殖過程中，經常會使用衛生殺蟲劑來維持場內環境，如使用菊酯類、有機磷類等來消滅雞羽虱[2]等。一些不易降解的農藥會經過禽類飼料等食物鏈的傳遞、富集，進入禽蛋并積累其中[3]。人們如果長期食用含有農藥甚至超標的禽蛋，可引起慢性中毒；農藥長期在人體內累積會產生致畸、致癌和致突變作用[4]。因此，建立禽蛋中農藥多殘留的快速精準檢測方法，具有非常重要的現實意義。

現行農藥殘留檢測標準大都針對植物源性食品[5-6]，禽蛋中農藥殘留檢測標準大多集中在氟蟲腈及其代謝物的農藥殘留[7]，諸多農藥殘留缺乏有效的檢測標準。動物源性食品中農藥殘留樣品前處理方法主要有固相萃取法[8]、加速溶劑萃取法[9]、凝膠滲透色譜法[10]及QuEChERS 法[11]等。與前3 種方法相比，QuEChERS 法具有操作簡便、檢測成本低、環境友好、檢測高效等優勢，而且還可準確分離出殘留的農藥成分[12]。因此，本研究選取QuEChERS 方法作為樣品前處理方法。農藥殘留檢測方法主要有酶聯免疫吸附法[13-14]、氣相色譜法[15-16]、液相色譜法[17-18]、氣相色譜-質譜聯用法 (GC-MS/MS)[19-20]、液相色譜-質譜聯用法[21-22]等。其中GC-MS/MS 不僅適用于復雜基質混合物的定性分析，還可以利用得到的二級質譜結果進行定量，并具有較高的靈敏度。雖已有報道利用GC-MS/MS 檢測禽蛋中200 余種農藥殘留的方法，但該方法需要大量的有機試劑，操作繁瑣[23]。本研究基于本單位日常農產品例行檢測中檢出率較高的農藥和養殖場可能使用的衛生殺蟲劑，重點針對有機氯 (包括六六六、滴滴涕等)、有機磷及擬除蟲菊酯類等衛生殺蟲劑和農業生產中常用的農藥，在QuEChERS 樣品前處理方法基礎上，優化提取和凈化條件，建立了可同時檢測禽蛋中53 種農藥殘留的GC-MS/ MS 分析方法，旨在為禽蛋中農藥殘留的快速檢測提供可操作性強的實用分析技術。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及材料

Agilent 7890B/7000D 氣相色譜-串聯質譜儀，配有EI 離子源 (美國Agilent 公司)；艾本德5804R冷凍高速離心機 (德國EPPENDORF 公司)；KQ-500DE 數控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)；OA-SYS/N-EVAP-112 氮吹儀 (美國Organomation 公司)；MS7610-33 旋渦振蕩器 (美國Thermo Fisher 公司)；Milli-Q Direct 8 超純水儀(美國Millipore 公司)；AR1502CN 電子天平 (奧豪斯儀器有限公司)。

53 種農藥標準品均購自農業農村部環境保護科研監測所，質量濃度均為100 mg/L (液態標準物質)。

十八烷基硅烷 (C18，40～63 μm)、乙二胺-N-丙基硅烷 (PSA，40～63 μm)、石墨化碳黑 (GCB，120～400 目)、酸性氧化鋁 (7G010005)、堿性氧化鋁 (AG010005) 和硅藻土 (545) (德國CNW 公司)；弗羅里硅土 (0.150～0.250 mm) (美國WZ.der.Floridin公司)；超純硅膠 (60～200 μm) (加拿大SILICYCLE公司)；EMR 凈化管 (5 982～1 010) (美國Agilent 公司)；無水硫酸鎂和二氯甲烷 (分析純，西隴化工股份有限公司)；乙腈和正己烷 (分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；甲醇 (分析純，衢州巨化試劑有限公司)；丙酮 (分析純，浙江三鷹化學試劑有限公司)；乙酸乙酯 (分析純，上海展云化工有限公司)；乙酸乙酯和甲酸 (色譜純，德國默克公司)；0.22 μm 濾膜、1 mL 注射器和2 mL 樣品瓶 (上海安譜實驗科技股份有限公司)；試驗用水為Milli-Q Direct 8 超純水儀制備的超純水。

供試禽蛋品種包括雞蛋、鴨蛋、鴿子蛋、鵪鶉蛋和鵝蛋共5 種，為溫州市各縣市區農貿市場及養殖基地抽檢樣品。

1.2 檢測條件

色譜條件：HP-5MS 色譜柱 (30 m × 0.25 mm，0.25 μm，美國安捷倫科技有限公司)；載氣為氦氣，流速為2.25 mL/min；碰撞氣為氮氣，流速為1.5 mL/min；進樣口溫度290 ℃；傳輸線溫度280 ℃；柱升溫程序：初始溫度60 ℃ 保持1 min，以40 ℃/min 升至170 ℃，再以10 ℃/min 升至310 ℃，保持3 min；進樣體積1.0 μL；不分流進樣，不分流時間為1 min。

質譜條件：電子轟擊離子源 (EI)；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離能70 eV；質譜接口溫度280 ℃；動態多反應監測模式 (dMRM)；總運行時間20.75 min。53 種農藥的保留時間及質譜參數 (按出峰順序) 見表1，典型色譜圖見圖1。

續表1Table 1 (Continued)

1.3 樣品前處理方法

樣品制備：取約1.5 kg 禽蛋，去殼后用組織勻漿機充分攪拌均勻，于 -20 ℃保存，待測。

稱取2.50 g 均質樣品于50 mL 離心管中，加入10.00 mL 乙酸乙酯，超聲30 min；加入2.0 g無水硫酸鎂，渦旋1 min 后于6 000 r/min、-4 ℃下離心5 min；取6 mL 上清液于15 mL離心管中，加入900 mg 無水硫酸鎂、150 mg 弗羅里硅土和300 mg 硅藻土，渦旋30 s 后于10 000 r/min、-4 ℃下離心5 min；取4.00 mL 上清液于5 mL 試管中，40 ℃水浴下氮吹至近干，用1.00 mL 乙酸乙酯復溶，過0.22 μm 濾膜，待測。

1.4 標準溶液配制

標準品混合中間液1 (1.00 mg/L)的配制：準確移取53 種農藥標準品各0.100 mL 于10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度線，于4 ℃保存，備用。

標準品混合中間液2 (0.40 mg/L，以甲基毒死蜱計) 配制：按53 種農藥標準品的定量限比例，分別移取一定體積的農藥標準品溶液于10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度線，于4 ℃保存，備用。

基質匹配混合標準溶液1 配制：臨用時，用乙酸乙酯溶液溶解的樣品空白基質提取液，稀釋標準品混合中間液1，配制成0.10、0. 20、0.50、1、2、5、10、20 和50 μg/L 系列質量濃度的基質匹配標準混合工作溶液1，用于確定儀器的檢出限和方法的定量限。

基質匹配混合標準溶液2 配制：臨用時，用乙酸乙酯溶液溶解的樣品空白基質提取液，稀釋標準品混合中間液2，配制成1、2、5、10、20 和50 μg/L (以甲基毒死蜱計) 系列質量濃度的基質匹配標準混合工作溶液2，用于確定方法的線性范圍、準確度和精密度。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理方法的優化

2.1.1 樣品提取 以雞蛋為研究對象，通過添加回收試驗，考察了不同溶劑對53 種農藥的提取效果。稱取2.50 g 樣品 (每個處理3 個平行、1 個空白)，添加250 μL 標準品混合中間液1，靜置30 min后加入10.00 mL 提取溶劑，超聲30 min 后加入2.0 g 無水硫酸鎂，渦旋1 min 后于6 000 r/min、-4 ℃下離心5 min；取上清液，過0.22 μm 濾膜，待GC-MS/MS 檢測，空白基質匹配標準溶液外標法標準曲線定量。結果顯示：乙腈、乙酸乙酯的提取效果較其他溶劑更好 (表2)。龐國芳等的研究表明，在提取液中加入緩沖試劑如甲酸，對維持溶液的pH 值及降低敏感性藥物的降解有很好的作用[24-26]，故本研究考察了加入體積分數1%的甲酸對提取效果的影響。結果顯示，在乙腈中加入1%的甲酸對目標物的提取效果影響不明顯。考慮到乙酸乙酯的價格、毒性均較乙腈低，因此選擇乙酸乙酯為提取溶劑。

表2 不同提取溶劑對53 種農藥提取效果的影響 (n = 3)Table 2 Extraction efficiency of different extraction solvents on 53 pesticides (n = 3)

2.1.2 樣品凈化

2.1.2.1 吸附情況 本研究除對QuEChERS 方法常用凈化材料C18、PSA 和GCB 進行考察外，還對超純硅膠、弗羅里硅土、硅藻土、酸性氧化鋁、堿性氧化鋁和EMR 等常見的固相萃取柱填料進行了研究。GCB 雖然能夠強烈吸附色素類物質，但它對非極性農藥也有吸附作用，會降低大部分農藥的回收率[27-28]。因此，本研究考察了備選凈化材料對待測目標物的吸附情況。在2.1.1 節優化的提取條件下，取6 mL 空白雞蛋樣品提取液于15 mL 離心管中，添加600 μL 的標準品混合中間液1，渦旋、混勻；加入900 mg 無水硫酸鎂、150 mg 凈化劑 (每個處理3 個平行、1 個空白)，渦旋30 s 后于10 000 r/min、-4 ℃下離心5 min；取上清液，過0.22 μm 濾膜，待GC-MS/MS 檢測，空白基質匹配標準溶液外標法標準曲線定量。結果顯示：9 種凈化劑對目標物的吸附性不強，目標物的回收率均可達到要求 (表3)。

2.1.2.2 基質效應 本研究采用相對響應值法對基質效應進行評價 (基質效應 = 空白基質標準響應值/純溶劑標準響應值)，當基質效應小于1 時為基質抑制效應，反之則為基質增強效應[29]。對雞蛋進行基質效應評價的結果顯示弗羅里硅土和硅藻土的凈化效果優于其他7 種凈化劑。為了提高凈化效果，降低基質效應，本研究又考察了弗羅里硅土和硅藻土組合對目標物的吸附情況及凈化效果，結果顯示目標物的回收率均可達到要求 (表3)，其中凈化劑150 mg 弗羅里硅土 + 300 mg 硅藻土組合，43 種農藥的基質效應在0.80～1.20 之間，凈化效果優于其他組合 (表4)。為提高靈敏度，本研究取4.00 mL 凈化液，于40 ℃水浴氮吹至近干，用1.00 mL 乙酸乙酯復溶，過0.22 μm 濾膜，GC-MS/MS 檢測，空白基質匹配標準溶液外標法定量。結果顯示目標物的回收率亦均可達到要求(表3)。基于此，本研究凈化方法最終選擇150 mg 弗羅里硅土 + 300 mg 硅藻土，并選用空白基質匹配標準溶液外標法標準曲線定量的方式來減弱基質效應的影響。

表3 不同凈化劑對53 種農藥回收率的影響Table 3 Recoveries of 53 pesticides with different clean up sorbents

表4 不同凈化劑對53 種農藥的基質效應評價Table 4 Matrix effect of 53 pesticides with different cleanup sorbents

2.2 方法評價

2.2.1 線性范圍、檢出限及定量限 取基質匹配混合標準工作溶液1，在上述優化的檢測條件下，經GC-MS/MS 測定后，以目標物質量濃度為橫坐標 (x)，質譜定量離子的峰面積為縱坐標 (y)，繪制標準曲線。參考GB/T 33 260.2—2018 計算目標物的儀器檢出限[30]。結果 (表5) 表明，儀器檢出限(LOD) 在0.000 25～0.005 mg/L 之間。方法定量限(LOQ) 以最小添加濃度且可準確定量的水平予以評價，則在0.000 5～0.01 mg/kg 之間。

確定了每個待測目標物的定量限后，取基質匹配混合標準溶液2，在上述優化的檢測條件下，經GC-MS/MS 測定后，計算線性范圍，繪制標準曲線。結果 (表5) 表明，目標物的線性相關系數在0.996 7～1 之間，能夠滿足定量分析的基本要求[31]。

表5 53 種農藥的線性回歸方程、相關系數、檢出限和定量限Table 5 Linear regression equation, r, LOD and LOQ of 53 pesticides

續表5Table 5 (Continued)

2.2.2 方法的添加回收準確度與精密度 向雞蛋中添加適當體積的53 種標準品混合中間液2，添加水平均分別為LOQ、2 LOQ 和10 LOQ。由表6可知，53 種化合物在雞蛋中的平均回收率在76%～104%之間，相對標準偏差 (RSD) 在0.090%～14%之間 (n= 6)，表明方法具有較好的回收率和重現性[31]。

表6 53 種農藥在雞蛋中的平均添加回收率及相對標準偏差 (n = 6)Table 6 Average recoveries and relative standard deviation of 53 pesticides in hen’s eggs (n = 6)

續表6Table 6 (Continued)

2.3 實際樣品測定結果

運用本研究建立的檢測方法，對溫州市各縣市區銷售流通環節64 個點抽檢的101 個禽蛋樣品進行分析 (每個樣品2 個重復)，每個樣品抽取1.5 kg左右。結果表明：51 個雞蛋樣品累計檢出11 種農藥，檢出率在2%～69%之間；36 個鴨蛋樣品累計檢出7 種農藥，檢出率在3%～69 之間；6 個鴿子蛋、4 個鵪鶉蛋和4 個鵝蛋樣品均累計檢出毒死蜱、馬拉硫磷，檢出率在50%～100%之間。參考《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》[32]，所有檢出農藥均未超標。實際樣品的檢測結果見表7，檢出參數的多反應監測圖見圖2。

表7 實際市場抽檢樣品中53 種農藥殘留檢測結果Table 7 Detection results of 53 pesticides in market samples

本研究中，1 個雞蛋樣品檢出氟蟲腈的代謝物氟蟲腈砜，不排除目前養殖場仍存在使用氟蟲腈等殺蟲效果較強、對人類危害較大農藥的可能性；雖然毒死蜱、馬拉硫磷的檢出濃度較低，但整體檢出率較高，這可能與養殖場大量、普遍使用衛生殺蟲劑來維持場內環境，或取食的植物性飼料中含有這些農藥殘留有關[2]。因此建議加強動物源性農藥代謝物的檢測與研究，以便為食品安全管理作出正確的決策提供參考。

3 結論

本研究利用基質分散固相萃取法結合氣相色譜-串聯質譜技術，建立了禽蛋中農藥殘留多指標同步定性、定量檢測的分析方法。本方法使用改良的QuEChERS 前處理技術，氣相色譜-串聯質譜測定，基質匹配外標法標準曲線定量。對測定方法進行方法學驗證，結果表明，53 種農藥的儀器檢出限在0.000 25～0.005 mg/L 之間，方法定量限在0.000 5～0.01 mg/kg 之間，目標物的線性相關系數 (r) 在0.996 7～1 之間；在LOQ、2 LOQ 和10 LOQ 3 個添加水平下，53 種農藥在雞蛋中的平均添加回收率在76%～104% 之間，相對標準偏差在0.090%～14%之間 (n= 6)。該方法準確、快捷、靈敏，為我國禽蛋中農藥殘留的高通量快速檢測以及食品安全提供了科學支持和技術保障，對于推進政府監管部門執法、提高檢測效率、降低檢測成本等均具有一定的實際意義和社會效益，可應用于禽蛋食品安全日常監測。