基于Pro-197-Ser突變的抗雙氟磺草胺薺菜的快速檢測

李琦，于金萍，郭文磊，劉亦學，張惟

摘要：雙氟磺草胺是防除小麥田薺菜（Capsella bursa-pastoris）等闊葉雜草的主要除草劑品種之一，目前在我國河南、河北、天津等地已有薺菜種群對其產生了抗藥性。乙酰乳酸合成酶（ALS）基因第197位位點核苷酸突變是薺菜對雙氟磺草胺產生抗藥性的主要原因，通過在引物 D197F 序列的 3′ 端引入錯配堿基，設計出一種衍生性酶切擴增多態性序列 （dCAPS） 分子標記方法，可用于第197位位點核苷酸突變的快速檢測。抗藥性及敏感薺菜的ALS基因擴增片段經限制性內切酶AvaⅡ酶切后表現出多態性，敏感薺菜產生了31、192 bp等2個片段;抗藥性薺菜產生了31、192、223 bp等3個片段。該方法檢測結果準確、可靠，與整株水平測定結果一致，并適用于第197位位點的任意氨基酸取代。這種dCAPS分子標記方法可對田間當季雜草進行檢測，可為薺菜種群抗藥性的快速檢測與監測提供理論支持。

關鍵詞：薺菜;雙氟磺草胺;靶標抗藥性;ALS基因;dCAPS

中圖分類號：S481.4;S482.4文獻標志碼：A文章編號：1003-935X（2021）02-0014-06

Rapid Detection of Pro-197-Ser Mutation Endowing Target-Site

Resistance to Florasulam in Capsella bursa-pastorisLI Qi1，YU Jinping1，GUO Wenlei2，LIU Yixue1，ZHANG Wei1

（1.Institute of Plant Protection，Tianjin Academy of Agricultural Sciences，Tianjin 300381，China;

2.Plant Protection Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong

Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection，Guangzhou 510640，China）Abstract：Florasulam is widely used in wheat fields to control Capsella bursa-pastoris and other broadleaf weeds. However，some C. bursa-pastoris populations have evolved resistance to florasulam in Henan，Hebei and Tianjin，China. The mutation occurring at ALS gene at 197 codon is a main mechanism causing florasulam resistance in C. bursa-pastoris. We introduced a mismatched base at 3′-end of the primer D197F and designed a dCAPS method to detect the mutation of ALS gene at 197 codon rapidly. The ALS fragments amplified between resistant and susceptible C. bursa-pastoris plants showed polymorphisms after digestion by the restriction enzyme AvaⅡ. The susceptible plants produced two fragments （31 bp and 192 bp）. Resistant plants produced three fragments （31 bp，192 bp and 223 bp）. Results were accurate and reliable，and were consistent with the whole-plant experiments. Moreover，the method was suitable for any mutations at ALS 197 codon by detecting resistance in season. This study provides a procedure to detect and monitor ALS herbicide-resistance in C. bursa-pastoris.

Key words：Capsella bursa-pastoris;florasulam;target resistance;ALS gene;dCAPS

薺菜（Capsella bursa-pastoris）是我國常見的闊葉雜草，廣泛分布于長江流域、華北地區和西南地區作物田，主要危害油菜、稻茬麥、冬小麥等冬春作物。薺菜具有很強的耐低溫及耐干旱能力，環境適應性強，在田間與作物競爭，嚴重影響著作物的質量與產量[1]。雙氟磺草胺（florasulam）是由美國陶氏化學公司開發的三唑并嘧啶磺酰胺類除草劑，被廣泛用于防除小麥田闊葉雜草，其作用機制是通過抑制乙酰乳酸合成酶（ALS）的活性，使雜草無法合成亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸這 3種氨基酸而死亡，是一種典型的乙酰乳酸合成酶抑制劑[2]。

由于具有高選擇性、高活性、低毒、低殘留的特點，乙酰乳酸合成酶抑制劑類除草劑被長期大量使用，導致雜草抗藥性的發生非常嚴重，截至目前，全球已有165種雜草對 ALS類除草劑產生了抗藥性[3-4]。除草劑作用靶標位點的氨基酸發生突變，影響除草劑與靶標酶的結合是抗藥性產生最普遍的分子機制。目前，有報道顯示，ALS基因中有8個氨基酸位點發生的27種氨基酸突變形式與抗藥性相關[4]。根據報道，薺菜對ALS類除草劑產生抗藥性的靶標機制包括Pro-197-His、Pro-197-Leu、Pro-197-Arg、Pro-197-Thr、Pro-197-Ser、Pro-197-Ala、 Trp-574-Leu等7種氨基酸突變形式[5-6]。

雜草對除草劑產生抗藥性是一個不斷發展和演化的過程[7]，因此，加強對田間抗藥性雜草的調查[8-9]，對處于抗藥初期的雜草進行準確快速的檢測，才能最大程度地減少抗藥性雜草對農業生產的危害。目前，常用于雜草抗藥性檢測的方法主要有溫室整株植物鑒定法[10]、抗性當季快速檢測（resistance in season quick test，RISQ） 法[11]、種子培養皿法[12]、靶標酶基因測序法[13]、酶切擴增多態性檢測法[14]等。其中，溫室整株植物鑒定法、RISQ法與種子培養皿法簡單易行，結果直觀，對試驗儀器要求低，可以針對不同雜草的各種抗藥性機制進行檢測，但是檢測效率低、速度慢，需要占用大量的試驗空間，不適宜于大量樣品同時檢測;靶標酶基因測序法的結果準確，已廣泛應用于多種除草劑抗藥性檢測中，但是該方法對試驗儀器要求高，試驗結果不夠直觀，須要進行進一步的生物學分析;酶切擴增多態性檢測法（derived cleaved amplified polymorphic sequence，dCAPS） 通過在擴增引物中引入錯配堿基提供限制性內切酶的識別位點，根據限制性內切酶產生不同長度的酶切片段，判斷特定突變的基因和正常的基因，其操作簡單、檢測方便、結果直觀、成本低、周期短，可以對大量樣品同時進行檢測，但其只能檢測已知的單一突變位點。本研究針對在薺菜中最常見的ALS基因197位突變位點設計了 dCAPS 標記方法，以期在薺菜抗藥性愈發嚴重的情況下，為其快速檢測提供理論依據。

1材料與方法

1.1供試材料

雜草種子：2018年6月，從天津市薊州區小麥田采集薺菜種群TJ07;另從天津市農業科學院核心區內非耕地處（該地未使用過任何除草劑）采集1個種群作為敏感對照，編號為TJ12。薺菜種群采集信息見表1。

1.2主要儀器

ASS-4型化學農藥實驗自動控制噴灑系統，購自北京盛恒天寶科技有限公司;5804R型臺式高速冷凍離心機，購自德國 Eppendorf 公司;T100型PCR儀，購自美國Bio-Rad公司;DYY-8C型電泳儀，購自北京六一生物科技有限公司;HDL潔表1薺菜種群采集地點

Table 1Collection location of C. bursa-pastoris populations

種群編號采樣點經緯度TJ07天津市薊州區侯家營鎮韓莊子村39°52′36″N，117°16′3″ETJ12天津市農業科學院核心區39°6′14″N，117°3′32″E

凈工作臺，購自北京東聯哈爾儀器制造有限公司;RXZ-280C植物培養箱，購自寧波江南儀器廠;GL2200凝膠成像系統，購自美國柯達公司。

1.3試驗方法

1.3.1薺菜對雙氟磺草胺的抗藥性水平測定采用整株水平測定法測定薺菜對雙氟磺草胺的抗藥性[15]。薺菜種子催芽方法同文獻[16]。將15粒露白的薺菜種子均勻地播種于直徑為12 cm的塑料盆內，置于可控溫室中培養（自然光照，溫度為20～35 ℃，相對濕度為50%～70%）。生長至2葉期時間苗，每盆留長勢基本一致的薺菜10株。待長至3～4葉期，用ASS-4型自動農藥定量噴霧系統進行莖葉噴霧。噴霧壓力為0.275 MPa，噴液量為450 L/hm2。設定雙氟磺草胺的處理劑量（有效成分用量）：抗藥性（R）種群的為0、0.06、030、1.50、7.50、37.50、187.50 g/hm2;敏感（S）種群的為0、0.012、0.060、0.300、1.500、7.500、37.500 g/hm2。每個處理重復3次，試驗共重復2次。噴藥后21 d，剪取薺菜地上部分，于恒溫干燥箱內75 ℃烘干72 h，稱量干重并記錄。

1.3.2薺菜ALS基因片段克隆待薺菜生長至4葉期后，采用植物基因組DNA提取試劑盒（北京全式金生物技術有限公司），從敏感、抗藥性種群中分別隨機選取5株薺菜以提取基因組DNA。采用已報道的2對引物序列[Forward 1 （5′-ATTCGTCTCCCGATTTGC-3′）/Reverse 1 （5′-GCCCGACACCAGTGCTTAT-3′）和Forward 2 （5′-GGTATCCCTGTTGCGAGTA-3′）? Reverse 2（5′-GCATACAAAGACCGTTTA-3′）]對薺菜ALS基因進行擴增[16]。引物由天津金唯智生物科技有限公司合成。PCR反應體系包括1 μL基因組DNA模板、1 μL 正向引物（10 μmol/L），1 μL反向引物（10 μmol/L）、12.5 μL 10×Easy Taq SuperMix（北京全式金生物技術有限公司），加雙蒸水至總體積為25 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，34個循環;72 ℃終延伸10 min。反應結束后，取5 μL擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，并將含目的條帶的擴增產物送天津金唯智生物科技有限公司測序。將測序所得序列與NCBI上的薺菜ALS基因進行比對，用軟件DNAMAN 6.0.3對擴增出的敏感、抗藥性薺菜的ALS基因進行比對分析。

1.3.3ALS 第197位位點 dCAPS 檢測分析用dCAPS 在線設計工具 dCAPS Finder 2.0[17]及引物設計軟件 Primer Premier 5.0，通過在薺菜ALS基因197位點附近人為引入AvaⅡ酶切位點，使抗藥性、敏感薺菜的ALS基因片段經限制性內切酶AvaⅡ酶切后表現出多態性，設計出1對引物 D197F 和 D197R（表2）。敏感薺菜ALS基因片段被完全酶切，含有31、192 bp等2個片段;純合突變抗藥性薺菜無法被酶切，只有223 bp 1個片段;雜合突變抗藥性薺菜同時含有31、192、223 bp等3個片段。PCR反應體系同“1.3.2”節。反應條件：94 ℃ 預變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火 40 s，72 ℃延伸30 s，38個循環;72 ℃終延伸 10 min。酶切反應體系包括 4 μL PCR 產物、1 μL限制性內切酶 （10 U/μL）、2 μL 10 × Buffer，加水至總體積為20 μL。限制性內切酶AvaⅡ反應溫度為37 ℃，酶切時間為30 min。酶切反應完成后，加入2 μL 10 × Loading Buffer混勻，取10 μL至 2.5%瓊脂糖凝膠中，在1×TAE電泳緩沖液中120 V電壓下電泳25 min。結束后通過紫外凝膠成像系統觀察并拍照。

1.3.4數據處理試驗數據采用雙邏輯非線性回歸模型y=C+{（D-C）/[1+（x/GR50） b]}擬合劑量反應曲線，計算抑制50%薺菜生長所需的除草劑劑量（GR50）。式中：y為除草劑某一劑量下薺菜干重相對于空白對照的百分比;x為除草劑表2用于薺菜 ALS 第197位位點 dCAPS 分析的引物信息

Table 2Primers used for dCAPS in ALS 197 codon of C. bursa-pastoris

引物序列（5′→3′）目標氨基酸位點退火溫度

（℃）酶識別位點預計酶切后片段大小（bp）野生型突變型D197FGTTCCTCTTGTAGCAATCACAGGACAGGTCPro197，CCT56AvaⅡ，GGWCC192，31223D197RGTTGCTGGATATCTTTAGGAATA注：引物中加粗及下劃線顯示的堿基表示人為設計的錯配以引入AvaⅡ切酶位點;限制性內切酶位點包含的堿基在引物和目標氨基酸位點中用下劃線標出。

劑量;C為劑量反應下限;D為劑量反應上限;b為斜率。

抗性倍數 （resistance index，RI）計算公式為RI=抗性種群的GR50/敏感種群的GR50。參考Beckie等的方法[18]對抗性倍數進行分級：敏感為RI<2，低水平抗性為2≤RI<5，中水平抗性為5≤RI≤10，高水平抗性為RI>10。

2結果與分析

2.1薺菜對雙氟磺草胺的抗藥性水平

整株水平測定結果（表3）表明，薺菜種群TJ07對雙氟磺草胺產生了高水平抗藥性，GR50為8.3 g a.i./hm2，與敏感種群TJ12相比抗性倍數為16.6。表3薺菜種群對雙氟磺草胺的抗性水平

Table 3Resistance ratio of C. bursa-pastoris populations to florasulam

種群回歸方程參數CDbGR50

（g a. i./hm2）抗性倍數

（倍）TJ070.0440.428-0.5428.3±7.416.6TJ120.1630.431-0.8650.5±0.21.0注：GR50數據為平均值±標準差。

2.2ALS基因片段測序

測序結果顯示，擴增所得ALS基因片段長度為1 738 bp，與NCBI中薺菜ALS基因序列（HQ880660.1）同源性達 99%以上，并且包含所有已經報道的8個抗性氨基酸突變位點。將抗藥性種群和敏感種群的ALS基因序列進行比對，發現抗藥性種群TJ07的5株被測植株中均存在? Pro-197-Ser （CCT-TCT）氨基酸突變形式，敏感種群TJ12的5株被測植株中均未發現已證實的ALS基因突變（圖1）。

2.3薺菜ALS基因第197位位點 dCAPS 檢測分析

本研究針對敏感薺菜ALS基因第197位位點設計酶切位點，使擴增的敏感薺菜ALS基因片段能夠被限制性內切酶識別并酶切。在引物D197F中引入1個錯配堿基，使得敏感ALS基因在第197位位點生成了1個AvaⅡ的酶切位點（GGWCC）。

以“2.2”節中薺菜基因組DNA為模板，采用引物D197F/D197R對5株抗藥性植株、5株敏感植株均擴增出一條223 bp的目的片段，與預期一致。用限制性內切酶AvaⅡ對PCR產物進行酶切，通過觀察電泳圖譜，5株敏感植株產生了31、192 bp 等2個條帶，5株抗藥性植株產生了31、192、223 bp 等3個條帶，但因 31 bp 的條帶較小，無法在電泳圖譜上顯示（圖2）。

3討論與結論

雜草對除草劑產生抗藥性是一個不斷發展的過程。據報道，ALS 抑制劑類除草劑在同一地塊連續重復使用3年以上，就可導致該地塊雜草產生抗藥性[19]。雙氟磺草胺是應用廣泛的一種麥田莖葉處理劑，若因雜草抗藥性導致防效差，會增加作物減產風險。因此，加強對田間抗藥性雜草的發生區域調查及監測在抗藥性雜草的治理中變得尤為重要。

目前常用的抗藥性雜草檢測方法，根據雜草的檢測層次可以分為表型檢測、生理生化檢測、分子檢測等[20]。表型檢測一般是指以生存率、死亡率、生物量等檢測指標去比較除草劑對抗敏植株效果的生物測定方法。鄒紅梅等采用瓊脂法實現了菵草對3種乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）抑制劑的快速檢測[21]，該類方法簡單易行，可檢測不同抗藥性機制，但需要較大空間，試驗周期偏長，費時費力，人為因素影響較大。生理生化檢測一般是指通過測定除草劑靶標酶及相關代謝酶的活性，判斷是否存在抗藥性，該方法對試驗技術及試驗環境要求較高。分子檢測是基于核酸水平，對目的植物基因進行分析的一種檢測方法，該類方法較多，不同的方法之間差別較大，對試驗技術、試驗設備以及試驗成本的要求也不同。崔海蘭等通過對靶標酶基因的擴增及測序，建立了豬殃殃靶標抗藥性快速檢測方法[22]，但該方法在2次測序反應以后，需要專業軟件對測序結果進行生物分析，對試驗人員要求較高，不適宜大規模推廣。

ALS基因發生核苷酸突變已被大量研究證明是雜草對ALS抑制劑類除草劑產生抗藥性的主要機制之一[3]。本研究通過引物D197F的錯配堿基引入內切酶AvaⅡ （GGWCC）酶切位點，采用dCAPS方法可檢測薺菜中ALS基因第197位的Pro-197-Ser （CCT-TCT）氨基酸突變形式。該方法對5株抗藥性植株和5株敏感植株的測定結果具有良好的一致性，說明本研究設計的 dCAPS分析方法可對雙氟磺草胺抗藥性薺菜Pro-197-Ser突變進行準確可靠的檢測。目前，薺菜被報道的ALS197位點突變形式主要有以下幾種：Pro-197-His （CCT-CAT）、Pro-197-Leu （CCT-CTT）、Pro-197-Arg （CCT-CGT）、Pro-197-Thr （CCT-ACT）、Pro-197-Ser （CCT-TCT）、Pro-197-Ala （CCT-GCT）[23]，雖然發生突變的堿基不同，但均為第197位密碼子的前2位堿基，而這2個堿基均包含在AvaⅡ內切酶的識別位點上，因此，本方法可以檢測到第197位位點多種形式的核苷酸變化。本研究中所檢測的TJ07種群，所有突變均為雜合，這可能是因為薺菜中含有多個ALS基因拷貝，使用dCAPS方法進行檢測，結果顯示的雜合是部分同源染色體雜合性，不是等位基因雜合[21]。

加強對田間抗藥性雜草的發生區域調查及監測，有利于在雜草抗藥性發展初期進行防治，最大程度減少抗藥性雜草對農業造成的危害。本研究構建了薺菜ALS基因第197位位點突變的dCAPS檢測方法，該方法操作簡單、結果直觀，可對田間當季雜草進行檢測。由于該方法只能對已知的單一靶標突變位點進行檢測，對于未知的突變位點以及非靶標抗藥性須要結合其他檢測方法鑒定。

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收稿日期：2020-11-30

基金項目：天津市農業科學院植物保護研究所所長創新基金（編號：20190001S）。

作者簡介：李琦（1990—），男，山東濟寧人，博士，助理研究員，主要從事農田雜草防除及雜草抗性機理研究。E-mail：liqi0309@hotmail.com。

通信作者：劉亦學，碩士，副研究員，主要從事除草劑應用技術研究。E-mail：liuyixue113@163.com。