功能性飼料添加劑對克氏原螯蝦非特異性免疫力及抗氧化能力的影響

萬金娟，薛暉，唐建清*，黃鴻兵，孟祥龍，田立立，孫敏，陳風蔚

（1.江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京 210017；2.揚州大學，江蘇 揚州 225009）

克氏原螯蝦（）俗稱小龍蝦，隸屬甲殼綱（Cmstacea），十足目（Decapoda），螯蝦科（Cambaridae），因其營養豐富、肉質鮮美以及特殊的飲食文化而受到消費者青睞。近年來，克氏原螯蝦的養殖規模逐年擴大，據統計，2019年我國克氏原螯蝦養殖總產量達208.96萬t，養殖總面積達128.6萬hm，與2018年相比分別增長27.52%和14.80%；其產量占淡水蝦養殖總產量的50%以上，成為我國目前重要的經濟水產養殖對象。隨著人工養殖規模的擴大，其病害問題也逐漸凸顯，給克氏原螯蝦產業帶來巨大損失。因此，如何提高克氏原螯蝦自身免疫力和健康狀況是產業迫切需要解決的問題之一。

隨著濫用抗生素造成的危害日漸為人們所知，在養殖過程中使用適當的功能性飼料添加劑，以提高水產動物的免疫能力，增強其抗病性成為當下研究的重點。其中，中草藥飼料添加劑已被報道在提高水產動物免疫力上發揮著重要作用。穿心蓮、大青葉、大黃、辣蓼等是中國傳統中藥材，具有激活機體免疫因子、調節免疫系統、抗氧化、抗病毒等功效；?；撬嵬瑯颖蛔C實具有促進水產動物生長、增強機體免疫和抗急性脅迫的能力。但有關飼料中添加中草藥和牛磺酸的復合添加劑對克氏原螯蝦的影響尚未見報道。現通過功能性飼料添加劑對克氏原螯蝦非特異性免疫力和抗氧化能力的影響的試驗，以期為克氏原螯蝦功能性飼料的研制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

以魚粉、花生粕、豆粕等為蛋白源，豆油、大豆磷脂油為脂肪源，配制基礎日糧，飼料配方及營養成分分析見表1和表2。同時，在基礎日糧中添加2%功能性飼料添加劑（項目組研制，其主要成分為穿心蓮、大青葉、大黃、辣蓼、?；撬岬龋瞥晒δ苄燥暳?。試驗飼料按照克氏原螯蝦商品料由江蘇海普瑞飼料有限公司加工制作。

表1 飼料組成① %

表2 飼料營養水平（風干基礎） %

1.2 試驗蝦與飼養管理

克氏原螯蝦由江蘇現代農業（克氏原螯蝦）產業技術體系基地提供。試驗池塘位于江蘇省淡水水產研究所揚中基地。蝦運至基地后，先在水泥池中暫養、馴化7 d，隨后挑選附肢完整、體格健壯、規格基本一致的幼蝦[初均體質量（9.84±1.17）g]，隨機分為2組（對照組D1，投喂普通商品料；試驗組D2，投喂功能性飼料），放入養殖池塘中。為保證2組養殖試驗條件的一致性，將1 334 m的塘從中間用防逃網隔成兩個667 m的試驗小塘口（栽種等量的水草）。每個試驗塘各投入15 kg幼蝦。試驗期間，每天19：00定量投喂1次，初始投飼量為蝦總體質量的4%，隨后日投飼量根據蝦的吃食情況進行調整，保證不過剩；減少人為干擾，每日觀察蝦的攝食及死亡情況，并及時將死蝦撈出，查明死亡原因，做好記錄；實時監測水質情況。

1.3 采樣與處理

在正式投喂前（0 d）以及投喂后10，20，30，40 d分別采樣，每次采樣前禁食24 h。采樣時，從每個試驗塘隨機選取體質量基本一致的雌、雄蝦各3尾，運至實驗室后，用1 mL的一次性注射器從每尾蝦的頭胸甲后部刺入心臟，抽取0.5 mL血淋巴，放入裝有等量抗凝劑（140 mmol/L NaCl，100 mmol/L葡萄糖，30 mmol/L檸檬酸三鈉，26 mmol/L檸檬酸，10 mmol/L NaDTA，pH值4.6）的1.5 mL離心管內，4℃靜置4 h，然后10 000 r/min離心10 min，取上清液，用于部分生理生化指標測定。隨后解剖，取出肝胰腺，置于-20℃冰箱中保存，用于檢測抗氧化指標。

1.4 指標測定

1.4.1 血淋巴生化指標的測定

選取溶菌酶（LZM）、堿性磷酸酶（ALP）、酸性磷酸酶（ACP）活性作為非特異性免疫指標。LZM、ALP、ACP的活性采用相應試劑盒方法測定，試劑盒均購自南京建成生物研究所。

1.4.2 肝胰腺抗氧化指標的測定

選取超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）作為抗氧化指標。SOD、CAT活性及MDA含量采用相應試劑盒方法測定，試劑盒均購自南京建成生物研究所。

1.5 數據統計與分析

同一采樣時間不同組之間的試驗數據用SPSS 23.0統計軟件中獨立樣本檢驗（Independent samples-test）進行差異顯著性分析；同一組不同采樣時間之間的試驗數據用SPSS23.0統計軟件中One-way ANOVA程序進行方差分析，并采用Duncan氏多重比較法進行差異統計學意義檢驗，結果均以“平均值±標準差”表示，當＜0.05時為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 功能性飼料添加劑對克氏原螯蝦血淋巴溶菌酶（LZM）活性的影響

功能性飼料添加劑對克氏原螯蝦血淋巴溶菌酶（LZM）活性的影響見圖1。由圖1可知，隨著投喂時間的增加，2組蝦血淋巴溶菌酶活力呈先降低后升高的變化趨勢。在投喂前及投喂后第10、20天時，2組間溶菌酶的活力差異不具有統計學意義（＞0.05）；投喂后第30、40天時，功能性飼料組蝦的溶菌酶活力均顯著高于對照組（＜0.05）。

圖1 功能性飼料添加劑對克氏原螯蝦血淋巴溶菌酶（LZM）活性的影響

2.2 功能性飼料添加劑對克氏原螯蝦血淋巴堿性磷酸酶（ALP）活性的影響

功能性飼料添加劑對克氏原螯蝦血淋巴堿性磷酸酶（ALP）活性的影響見圖2。由圖2可知，隨著投喂時間的增加，2組蝦血淋巴堿性磷酸酶的活性呈先升高后降低的趨勢。在投喂前以及投喂后期（30、40 d）時，兩組間堿性磷酸酶的活性差異不具有統計學意義（＞0.05）；投喂后第10、20天時，功能性飼料組蝦的堿性磷酸酶活力均顯著高于對照組（＜0.05）。

圖2 功能性飼料添加劑對克氏原螯蝦血淋巴堿性磷酸酶（ALP）活性的影響

2.3 功能性飼料添加劑對克氏原螯蝦血淋巴酸性磷酸酶（ACP）活性的影響

功能性飼料添加劑對克氏原螯蝦血淋巴酸性磷酸酶（ACP）活性的影響見圖3。由圖3可知，隨著投喂時間的增加，兩組蝦血淋巴酸性磷酸酶活性的變化同堿性磷酸酶一致，均呈先升高后降低的趨勢。在投喂前以及投喂后期（30、40 d）時，2組間酸性磷酸酶的活性差異不具有統計學意義（＞0.05）；投喂后第10、20天時，功能性飼料組蝦的酸性磷酸酶活力均顯著高于對照組（＜0.05）。

圖3 功能性飼料添加劑對克氏原螯蝦血淋巴酸性磷酸酶（ACP）活性的影響

2.4 功能性飼料添加劑對克氏原螯蝦肝胰腺超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

功能性飼料添加劑對克氏原螯蝦肝胰腺超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響見圖4。由圖4可知，隨著投喂時間的增加，兩組蝦肝胰腺超氧化物歧化酶活性呈略有降低的趨勢。在投喂前、后，兩組間超氧化物歧化酶的活性均差異不具有統計學意義（＞0.05）。

圖4 功能性飼料添加劑對克氏原螯蝦肝胰腺超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

2.5 功能性飼料添加劑對克氏原螯蝦肝胰腺過氧化氫酶（CAT）活性的影響

功能性飼料添加劑對克氏原螯蝦肝胰腺過氧化氫酶（CAT）活性的影響見圖5。由圖5可知，隨著投喂時間的增加，兩組蝦肝胰腺過氧化氫酶的活性呈逐漸降低的趨勢。在投喂前、后，兩組間過氧化氫酶的活性均差異不具有統計學意義（＞0.05）。

圖5 功能性飼料添加劑對克氏原螯蝦肝胰腺過氧化氫酶（CAT）活性的影響

2.6 功能性飼料添加劑對克氏原螯蝦肝胰腺丙二醛（MDA）含量的影響

功能性飼料添加劑對克氏原螯蝦肝胰腺丙二醛（MDA）含量的影響見圖6。由圖6可知，隨著投喂時間的增加，兩組蝦肝胰腺丙二醛的含量呈先升高后降低的趨勢。在投喂前及投喂后第10、40天時，兩組間丙二醛的含量差異不具有統計學意義（＞0.05）；投喂后第20、30天時，功能性飼料組蝦的丙二醛含量均顯著低于對照組（＜0.05）。

圖6 功能性飼料添加劑對克氏原螯蝦肝胰腺丙二醛（MDA）含量的影響

3 討論

已有研究結果表明，功能性飼料添加劑對水產動物具有促生長、提高免疫力、抗氧化和抗應激的能力。

血清LZM在甲殼動物機體內能破壞革蘭陽性菌細胞壁中的肽聚糖層，從而使機體抵御病原微生物的入侵。ALP和ACP是巨噬細胞溶酶體的標志酶，在甲殼動物免疫體系中是衡量機體免疫機能和健康狀況的重要標志。在該試驗中，功能性飼料組克氏原螯蝦血清LZM的活性在投喂后第30、40天，ALP和ACP的活性在投喂后10、20 d時顯著高于對照組，表明在基礎商品料中添加功能性飼料添加劑能提高蝦體LZM、ALP和ACP的活性，從而提高機體的免疫力。陳孝煊等用分別含1%的大黃、穿心蓮、板藍根和金銀花水提取物的餌料連續28 d飼喂異育銀鯽，結果顯示，投喂后第4、7天時，血清溶菌酶的活性顯著高于對照組；符云等報道，在飼料中添加一定量的復方中草藥制劑（主要成分為黃芪、金銀花、杜仲等），可以顯著提高凡納濱對蝦血清中的LZM、NOS、ALP和SOD等活性；崔青曼等在報道中指出，復方飼料添加劑（主要成分為海藻多糖、大黃、黃芪、連翹等）能顯著提高河蟹機體的免疫功能，與該研究結果一致。

正常狀態下，動物機體的抗氧化系統本身具有清除氧自由基的能力，抗氧化酶主要包括SOD、CAT和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）等；MDA是脂質過氧化的反應產物，其在機體中的積累程度可以反映機體過氧化受損狀況。有研究表明，復方中草藥（大黃、黃芪、連翹、黃芩和丹皮）、穿心蓮、?；撬崮芴岣甙c鮭、半滑舌鰨、虹鱒等水產動物的肝臟抗氧化能力。在該試驗中，功能性飼料添加劑的添加雖未顯著影響蝦肝胰腺SOD和CAT的活性，但蝦的肝胰腺MDA含量在投喂后第20、30天時顯著降低。表明中草藥和牛磺酸復方添加劑在一定程度上提高了克氏原螯蝦的抗氧化功能。這是因為，穿心蓮、大黃等中草藥的有效成分——穿心蓮內酯、大黃素等，可以抑制自由基生成，防止脂質過氧化，從而降低自由基毒性，起到抗氧化的作用；?；撬峥赡苁且驗槠渚哂蟹€定細胞膜脂質成分的能力，其具體作用機制還需進一步深入研究。