加味麻杏石甘湯對放射后肺泡Ⅱ型上皮細胞IL-6、TLR2、TLR4 表達的影響

陳 珠 鐘亞珍 陳 帥 林勝友

放射性肺損傷是胸部惡性腫瘤放療后常見的一種并發癥，包括早期的急性放射性肺炎和后期的放射性肺纖維化[1]。放射性肺損傷不僅限制腫瘤放療劑量，也影響后續的治療和患者的生存質量。本研究采用加味麻杏石甘湯在放射前干預肺泡Ⅱ型上皮細胞（AT-Ⅱ細胞），通過檢測各組白細胞介素-6（IL-6）、Toll樣受體2（TLR2）、Toll樣受體4（TLR4）mRNA 和蛋白的表達以及細胞活力，探討其干預放射性肺損傷的作用機制。

1 實驗材料

1.1 細胞與動物 AT-Ⅱ細胞株，美國ScienCell 公司提供；清潔級SD 大鼠18 只，體質量200～250g，雌雄各半，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK（滬）2013-0016。本實驗研究經浙江中醫藥大學實驗動物倫理委員會審核通過，審批號：2016226。動物實驗合格證號：SYXK（浙）2013-0184。實驗期間，動物自由進食，明暗各12h。

1.2 藥物與試劑 中藥飲片（炙麻黃、石膏、赤芍、杏仁、桑白皮、金銀花、甘草），購自杭州市腫瘤醫院，浙江中醫藥大學藥學院負責質控；阿米福汀，購于杭州市腫瘤醫院，大連美羅公司，批號53 171201；RMPI-1640 培養基，Hyclone 公司，批號SH30809.01B；胎牛血清，美國Gibco 公司，批號16000-044；Trizol 試劑，美國Invitrogen 公司，批號1596-026；SYBR Green Real-time PCR 試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒，美國Thermo 公司，批號分別為#K0223、PICPI23223；逆轉錄試劑盒，Fermentas 公司，批號#K1622；NC 膜，millipore 公司，批號HATF00010；IL-6、TLR2、TLR4一抗，美國Abcam 公司，批號分別為Ab6672、Ab16894、Ab13556；GAPDH 一抗，CST 公司，批號#5174；羊抗兔HRP 標記二抗、羊抗鼠HRP 標記二抗，碧云天公司，批號分別為A0208、A0216；青鏈霉素混合液（100X）、胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%），Solarbio 公司，批號分別為P1400-100、T1300-100；CCK-8 試劑，SAB 公司，批號CP002。

1.3 儀 器 ABI-7300型Real-time 檢測儀，美國ABI 公司；TG-16M型低溫冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；K30型旋渦振蕩器，青浦瀘西儀器廠；PRO200型電動勻漿機，FLUKO 公司；mini protean 3 cell型電泳儀，美國Bio-Rad 公司；PS-9型電轉儀，大連競邁科技有限公司；HI1210型水浴鍋，萊卡公司；Tanon-5200型成像系統，Tanon 公司；BHC-1300IIB2型生物安全柜，蘇州金凈凈化設備公司；Thermo Forma 3111型CO2型恒溫培養箱，美國Thermo 公司；XDS-500C型顯微鏡，上海蔡康光學儀器有限公司；DNM-9602型酶標分析儀，北京普朗新技術有限公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 AT-Ⅱ細胞放入含10%胎牛血清、1%雙抗（青鏈霉素混合液）的RMPI-1640 培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。顯微鏡下觀察細胞為貼壁細胞。

2.2 含藥血清制備 加味麻杏石甘湯由炙麻黃9g，石膏18g，赤芍、杏仁、桑白皮各12g，金銀花9g，甘草6g 組成，制成藥物濃度為2.44g/mL 水煎劑。將18 只大鼠按隨機數字表法分為對照組6 只，模型組12只。模型組按19.5g·kg-1·d-1予加味麻杏石甘湯煎液4mL，對照組予0.9%氯化鈉溶液4mL，灌胃給藥每天2 次，每次2mL，連續給藥3 天。末次給藥2h 后，以10%水合氯醛腹腔麻醉，腹主動脈取血，分別制備血清，滅活、過濾除菌、分管，同組血清混合，分裝至1mL 離心管中，-20℃凍存4 周使用，避免反復凍融。

2.3 分組及造模 將AT-Ⅱ細胞分為六組：空白對照組（10%正常大鼠血清）、模型組（10%正常大鼠血清）、含藥血清組（含藥血清濃度分別為2%、4%、10%）、阿米福汀組（10%正常大鼠血清，按4μg/mL阿米福汀[2]作用于細胞）。每組均設3 個復孔。X 線照射前藥物預培養0.5h，然后采用3.64Gray/min，總劑量8Gray 的X 線照射，照射后培養24h。

2.4 CCK-8 法檢測細胞增殖活力 將處于對數生長期的AT-Ⅱ細胞，顯微鏡下計數后制成3×104個/mL的細胞懸液，按3×103個/孔接種到96 孔培養板，37℃培養過夜。根據上述2.3 方法分組和處理，24h后，按1∶10 體積比混合CCK-8 和無血清必需基本培養基，向待測孔中加入含CCK-8 溶液100μL，在37℃、5%CO2培養箱中孵育1h，用酶標儀測定450nm波長處吸光度。

2.5 Real-time PCR 檢測IL-6、TLR2、TLR4 mRNA的表達 采用Trizol 法裂解細胞，提取細胞總mRNA后，檢測RNA 的濃度和純度，用逆轉錄試劑盒合成cDNA，采用25μL 體系進行Real-time PCR 擴增獲得基因片段。逆轉錄反應條件：37℃ 60min，85℃5min。Real-time PCR 反應條件：95℃預變性10min；40 個循環（95℃ 15s，60℃ 45s）。熔解曲線：95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。以GAPDH 作為內參，采用2-ΔΔCt法計算結果。引物如下：IL-6：forward 5'-GCACCTCAGATTGTTGTTG-3'，rverse 5'-AGTGTCCTAACGCTCATAC-3'；TLR2：forward 5'-GGTGTCTGGCATGTGCTGTG-3'，rverse 5'-GCTCCTGGACCATAAGGTTCTC-3'；TLR4：forward 5'-CCGCTTTCACTTCCTCTCAC-3'，rverse 5'-CATCCTGGCATCATCCTCAC-3'；GAPDH：forward 5'-AATCCCATCACCATCTTC-3'，rverse 5'-AGGCTGTTGTCATACTTC-3'。上述引物均由基爾頓生物科技（上海）有限公司合成。

2.6 Western blot 檢測IL-6、TLR2、TLR4 蛋白表達采用蛋白裂解液提取AT-Ⅱ細胞總蛋白，使用BCA 法蛋白定量，加入適量上樣緩沖液，沸水浴10min 變性；SDS-PAGE 凝膠上電泳后，采用半干轉法將蛋白電轉移至NC 膜；用5%脫脂奶粉室溫封閉1h 后，加入稀釋后的一抗，4℃孵育過夜；TBST 洗膜后，加入1:1000 稀釋HRP 標記的二抗，室溫孵育1h；TBST 洗膜后，加入ECL 發光液，顯影、定影，放入成像系統掃描。以GAPDH 作為蛋白內參。

2.7 統計學方法 應用SPSS 25.0 軟件對實驗數據進行統計分析。計量資料均符合正態分布，用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用Turkey 檢驗（方差齊）。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組AT-Ⅱ細胞活力比較 與空白對照組比較，射線照射后，模型組細胞活力顯著下降（P＜0.01）。與模型組比較，10%含藥血清組和阿米福汀組細胞活力顯著增加（P＜0.01）。與阿米福汀組比較，10%含藥血清組細胞活力差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組AT-Ⅱ細胞活力比較（%，±s）

表1 各組AT-Ⅱ細胞活力比較（%，±s）

注：空白對照組為10%正常大鼠血清處理細胞；模型組為10%正常大鼠血清處理細胞+X 線照射；2%、4%、10%含藥血清組分別為2%、4%、10%大鼠含藥血清處理細胞+X 線照射；阿米福汀組為10%正常大鼠血清和阿米福汀（4μg/mL）處理細胞+X 線照射；AT-Ⅱ細胞為肺泡Ⅱ型上皮細胞；與空白對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

3.2 各組AT-Ⅱ細胞IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 表達水平比較 與空白對照組比較，射線照射后，模型組IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 表達均顯著升高（P 均＜0.01）。與模型組比較，4%、10%含藥血清組和阿米福汀組IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 表達均顯著下降（P均＜0.01）。與阿米福汀組比較，10%含藥血清組IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組AT-Ⅱ細胞IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 表達水平比較（±s）

表2 各組AT-Ⅱ細胞IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 表達水平比較（±s）

注：空白對照組為10%正常大鼠血清處理細胞；模型組為10%正常大鼠血清處理細胞+X 線照射；2%、4%、10%含藥血清組分別為2%、4%、10%大鼠含藥血清處理細胞+X 線照射；阿米福汀組為10%正常大鼠血清和阿米福汀（4μg/mL）處理細胞+X 線照射；IL-6 為白細胞介素-6；TLR2 為Toll樣受體2；TLR4 為Toll樣受體4；與空白對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

3.3 各組AT-Ⅱ細胞IL-6、TLR2、TLR4 蛋白表達水平比較 與空白對照組比較，射線照射后，模型組IL-6、TLR2、TLR4 蛋白表達均顯著升高（P 均＜0.01）。與模型組比較，10%含藥血清組和阿米福汀組IL-6、TLR2、TLR4 蛋白表達顯著下降（P 均＜0.01）。與阿米福汀組比較，10%含藥血清組IL-6、TLR2、TLR4 蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組AT-Ⅱ細胞IL-6、TLR2、TLR4 蛋白表達

4 討論

放射性肺損傷是胸部惡性腫瘤放療的主要限制因素，發生率高達20.3%～36.9%[1，3]，降低了療效和患者的生存質量，嚴重時可導致死亡。阿米福汀是臨床上常用的細胞保護劑，Devine 和Marignol[4]通過Meta分析發現，阿米福汀可以使非小細胞肺癌患者放療后發生急性肺毒性的風險降低44%。但阿米福汀價格昂貴且副作用較大，難以廣泛應用。

Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs）是一種重要的模式識別受體，可通過識別配體參與細胞的固有免疫應答和炎癥反應[5]。肺泡上皮細胞可表達多種TLRs 參與固有免疫，包括TLR2 和TLR4[6]。研究表明，脂多糖誘導的急性肺損傷通過激活TLR4/NF-κB信號通路促進炎癥介質的釋放，如TNF-α、IL-6 等[7]，抑制TLR4/NF-κB 能改善LPS 誘發的急性肺損傷[8-9]。Kong 等[10]研究發現，甘草酸可通過抑制TLR2 減少脂多糖引起的急性肺損傷。李超等[11]研究表明，養陰清熱化瘀方可能通過抑制“TLR4/NF-κB”信號通路，發揮放射防護作用。

放射性肺損傷臨床表現為發熱、咳嗽、氣短乏力、咽干口燥等癥狀，可歸屬中醫“咳嗽”“喘癥”“肺痿”等范疇[12]。中醫認為，放射線屬熱毒燥邪，耗氣傷津，灼津煉液成痰，并可灼傷肺絡，日久損傷人體正氣和陰血。加味麻杏石甘湯在炙麻黃、石膏、杏仁、甘草的基礎上，加入赤芍、桑白皮、金銀花，以加強其清熱解毒，宣肺平喘之效。臨床經驗性用藥發現，加味麻杏石甘湯對放射性肺炎急性期的患者具有較好的治療效果[13]。本課題組前期實驗研究表明，麻杏石甘湯可以明顯減輕放療對大鼠模型的炎性損傷[14]，加味麻杏石甘湯對TGF-β1/Smad 信號轉導通路相關因子有多靶點的調控作用[15-16]。本研究結果顯示，10%含藥血清組細胞活力明顯高于模型組（P＜0.01），10%含藥血清組細胞中IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 和蛋白表達明顯低于模型組（P＜0.01）。提示加味麻杏石甘湯可改善輻射對AT-Ⅱ細胞增殖的抑制作用，并下調IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 和蛋白的表達。

綜上所述，加味麻杏石甘湯可能通過抑制TLR2、TLR4 表達，從而抑制TLR 信號通路的傳導及其下游炎癥因子IL-6 的釋放，減輕放射性肺損傷。此外，放射性肺損傷發病機制復雜，對加味麻杏石甘湯放射防護的詳細機制還有待進一步研究和探討。