二甲雙胍通過激活Nrf2 通路干預PC12 細胞H2O2氧化損傷的機制研究

盛 琦 王國濤 徐道劍

腦缺血是全世界發病率高和死亡率高的中樞神經系統損傷疾病[1]。研究發現，長時間嚴重缺血會導致神經細胞丟失、認知和運動功能障礙[1]。目前臨床采取溶栓法治療腦缺血，但溶栓后的血液再灌注會進一步通過誘導活性氧（reactive oxygen species，ROS）加重缺血區組織的損傷，即腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）[2]。因此，使用抗氧化劑或激活抗氧化通路誘導劑是治療腦缺血/再灌注的有效策略。二甲雙胍為雙胍類口服降血糖藥，臨床上用于肥胖的2型糖尿病[3]。相關研究發現，在腦缺血/再灌注模型中，二甲雙胍可減少神經損傷，促進神經細胞增殖和分化，減輕腦缺血/再灌注損傷[4]。Zhao 等[5]發現二甲雙胍通過激活AMPK 通路保護PC12 細胞和海馬神經元免受過氧化氫（H2O2）誘導的氧化損傷，但二甲雙胍對氧化應激的潛在保護作用及其機制需要進一步研究闡明。本研究通過建立H2O2誘導PC12 細胞氧化損傷模型探討二甲雙胍抗氧化機制，報道如下。

1 實驗材料

1.1 細 胞 大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤分化細胞（PC12 細胞）購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥 物 二甲雙胍（規格：1g/支，批號N304300，上海阿拉丁試劑有限公司）。

1.3 試 劑 CCK-8 試劑盒（批號C0037）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（批號C0016）、Hoechst 33342染色液（批號C1025）和ROS 檢測試劑盒（批號S0033S）購自碧云天生物有限公司。qRT-PCR 引物合成和Lipofectamine 2000 由賽默飛購得；核因子E2 相關因子2（Nrf2）（批號12721）、血紅素加氧酶-1（HO-1）（批號86806）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，批號5174）購自Cell Signaling 公司；胎牛血清（批號30044333）購自Gibco 公司；H2O2（批號H112517）和多聚甲醛（批號C104188）購自上海阿拉丁有限公司。

2 方 法

2.1 細胞培養 將PC12 細胞培養在含有10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100μg/mL 鏈霉素的RPMI-1640 培養液中，在5%CO2、37℃的培養箱內培養待使用。

2.2 細胞分組 將PC12 細胞分別設置五組，DMSO組，H2O2組，二甲雙胍低（0.5mmol/L）、中（1mmol/L）、高（2mmol/L）劑量組。

2.3 細胞活力檢測 取對數生長期的PC12 細胞接種在96 孔板上，并放置過夜。用不同濃度二甲雙胍（0.5、1 和2mmol/L）處理24h 后，再用100μmol/L H2O2處理24h。將10μL 的CCK-8 溶液添加到每個孔中，將細胞在培養箱中培養1h，并通過自動酶標儀對450nm 處的吸光度進行定量，最后計算每組細胞活力的相對百分數。

2.4 LDH 測定 取對數生長期的PC12 細胞接種在96 孔板上，并放置過夜。用不同濃度（0.5、1 和2mmol/L）的二甲雙胍處理24h 后，再用100μmol/L H2O2處理24h，然后根據說明書的實驗步驟確定每組培養基中釋放的LDH 的活性。

2.5 Hoechst 33342 染色法檢測細胞凋亡 取對數生長期的PC12 細胞接種在6 孔板上，并放置過夜。用不同濃度（0.5、1 和2mmol/L）二甲雙胍處理24h后，再用100μmol/L H2O2處理24h。在4℃下用4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖鹽水固定10min，然后將細胞與Hoechst 33342 染色液孵育20min 以染色細胞核。用PBS 洗滌2 次后，在熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞，計算每組凋亡率。

2.6 ROS 水平測定 取對數生長期的PC12 細胞接種在6 孔板上，并放置過夜。用不同濃度（0.5、1 和2mmol/L）二甲雙胍處理24h 后，再用100μmol/L H2O2處理3h。室溫避光加入DCFH-DA 后孵育30min。細胞消化并用PBS 沖洗，離心，通過流式儀檢測ROS 含量，計算每組ROS 的水平。

2.7 Nrf2 和HO-1 mRNA 水平測定 取對數生長期的PC12 細胞接種在6 孔板上，并放置過夜。用不同濃度二甲雙胍（0.5、1 和2mmol/L）處理24h 后，收集細胞，用TRIzol 試劑提取總RNA 并檢測RNA 的質量和數量。然后，用M-MLV 逆轉錄酶進行逆轉錄及進行進一步的PCR 反應，最后計算每組的相對mRNA 含量，GAPDH 被用作內部對照。其中引物序列見表1。

表1 基因引物序列

2.8 Nrf2 和HO-1 蛋白水平測定 取對數生長期的PC12 細胞接種在6 孔板上，并放置過夜。用不同濃度二甲雙胍（0.5、1 和2mmol/L）處理48h 后，裂解蛋白并收集蛋白，變性得到蛋白樣品。將等量蛋白質的樣品在聚丙烯酰胺凝膠上分離，然后轉移至聚偏二氟乙烯膜上，并分別用Nrf2 和HO-1 一抗在4℃孵育過夜。TBST 洗滌膜后，用二抗在室溫下孵育1.5h，洗滌后于ECL 孵育顯影凝膠成像系統中曝光成像，使用ImageJ 軟件對每組條帶的強度進行定量分析。

2.9 沉默Nrf2基因測定細胞保護作用 取對數生長期的PC12 細胞接種在6 孔板上，并放置過夜。將稀釋的siRNA 和Lipfectamine2000 試劑混合均勻，室溫下放置20min，再將混合液加入到6 孔板中；加入不同濃度（0.5、1 和2mmol/L）二甲雙胍孵育16h，再加入H2O2損傷24h。用MTT 溶液在37℃處理細胞。甲瓚晶體溶解，并通過自動酶標儀對450nm 處的吸光度進行定量，計算每組細胞活力的相對百分數。siRNA 引物序分別如下：siRNA Nrf2：上游引物5'-GGGUAAGUCGAGAAGUGUUTT-3'，下游引物5'-AACACUUCUCGACUUACCCTT-3'。

2.10 統計學方法 每組實驗重復3 次，實驗數據用均數±標準差（±s）表示，應用SPSS 25.0 統計軟件進行數據整理分析，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較使用t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 二甲雙胍對PC12 細胞的損傷作用 與DMSO組比較，隨著濃度的遞增，二甲雙胍對PC12 細胞毒副作用減弱（P＜0.05）。見表2。

表2 二甲雙胍對PC12 細胞的損傷作用（%，±s）

表2 二甲雙胍對PC12 細胞的損傷作用（%，±s）

注：DMSO 組為DMSO 處理；二甲雙胍低劑量組為0.5mmol/L 二甲雙胍處理；二甲雙胍中劑量組為1mmol/L 二甲雙胍處理；二甲雙胍高劑量組為2mmol/L 二甲雙胍處理；DMSO 為二甲基亞砜；與DMSO 組比較，aP＜0.05

3.2 二甲雙胍對H2O2誘導PC12 細胞損傷的保護作用 與H2O2組比較，隨著濃度增加二甲雙胍能依賴性提高H2O2誘導PC12 細胞的細胞活力（P＜0.05）。見表3。

表3 二甲雙胍對H2O2 誘導PC12 細胞損傷的保護作用（%，±s）

表3 二甲雙胍對H2O2 誘導PC12 細胞損傷的保護作用（%，±s）

注：DMSO 組為DMSO 處理；H2O2 組為H2O2 處理；二甲雙胍低劑量+H2O2 組為0.5mmol/L 二甲雙胍+H2O2 處理；二甲雙胍中劑量+H2O2組為1mmol/L 二甲雙胍+H2O2 處理；二甲雙胍高劑量+H2O2 組為2mmol/L 二甲雙胍+H2O2 處理；DMSO 為二甲基亞砜；與DMSO 組比較，aP＜0.05；與H2O2 組比較，bP＜0.05

3.3 二甲雙胍減少H2O2作用下LDH 的釋放量 與DMSO 組比較，PC12 細胞經H2O2作用，細胞內的LDH 釋放量增加。但當高劑量二甲雙胍與H2O2聯合作用后，細胞內的LDH 釋放量降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組PC12 細胞LDH 釋放量比較（±s）

表4 各組PC12 細胞LDH 釋放量比較（±s）

注：DMSO 組為DMSO 處理；H2O2 組為H2O2 處理；二甲雙胍高劑量+H2O2 組為2mmol/L 二甲雙胍+H2O2 處理；DMSO 為二甲基亞砜；與DMSO 組比較，aP＜0.05；與H2O2 組比較，bP＜0.05

3.4 二甲雙胍降低H2O2誘導的細胞凋亡 與DMSO 組比較，PC12 細胞經H2O2作用，細胞凋亡率增加。但當二甲雙胍與H2O2聯合作用后，細胞凋亡率降低（P＜0.05）。見表5，圖1。

圖1 二甲雙胍降低H2O2 誘導的細胞凋亡（×200）

表5 各組PC12 細胞凋亡率比較（%，±s）

表5 各組PC12 細胞凋亡率比較（%，±s）

注：DMSO 組為DMSO 處理；H2O2 組為H2O2 處理；二甲雙胍高劑量+H2O2 組為2mmol/L 二甲雙胍+H2O2 處理；DMSO 為二甲基亞砜；與DMSO 組比較，aP＜0.05；與H2O2 組比較，bP＜0.05

3.5 二甲雙胍降低H2O2導致的ROS 水平 與DMSO 組比較，PC12 細胞經H2O2作用，細胞ROS 水平升高（P＜0.05）。但當二甲雙胍與H2O2聯合作用后，細胞ROS 水平降低（P＜0.05）。見表6。

表6 各組PC12 細胞ROS 含量比較（%，±s）

表6 各組PC12 細胞ROS 含量比較（%，±s）

注：DMSO 組為DMSO 處理；H2O2 組為H2O2 處理；二甲雙胍高劑量+H2O2 組為2mmol/L 二甲雙胍+H2O2 處理；DMSO 為二甲基亞砜；與DMSO 組比較，aP＜0.05；與H2O2 組比較，bP＜0.05

3.6 二甲雙胍激活Nrf2/HO-1 信號通路 與DMSO組比較，二甲雙胍能夠濃度依賴性地提高Nrf2 和HO-1 mRNA 水平（P＜0.05）。Western blot 結果顯示，二甲雙胍能夠濃度依賴性地提高Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平（P＜0.05）。見表7-8，圖2。

圖2 二甲雙胍提高Nrf2 和HO-1 蛋白表達

表7 各組Nrf2 和HO-1 mRNA 相對表達量比較（±s）

表7 各組Nrf2 和HO-1 mRNA 相對表達量比較（±s）

注：DMSO 組為DMSO 處理；H2O2 組為H2O2 處理；二甲雙胍低劑量組為0.5mmol/L 二甲雙胍處理；二甲雙胍中劑量組為1mmol/L 二甲雙胍處理；二甲雙胍高劑量組為2mmol/L 二甲雙胍處理；DMSO 為二甲基亞砜；與DMSO 組比較，aP＜0.05

3.7 二甲雙胍通過Nrf2 的激活起到保護作用DMSO 組細胞活力（100.00±0.00）；H2O2組細胞活力（62.33±3.21）；二甲雙胍高劑量+H2O2組細胞活力（78.02±7.63）；二甲雙胍高劑量+H2O2+siNrf2 組細胞活力（59.77±2.25）。與二甲雙胍高劑量+H2O2組比較，沉默Nrf2 后細胞存活率降低（P＜0.05）。

表8 各組Nrf2 和HO-1 蛋白相對表達量比較（±s）

表8 各組Nrf2 和HO-1 蛋白相對表達量比較（±s）

注：DMSO 組為DMSO 處理；H2O2 組為H2O2 處理；二甲雙胍低劑量組為0.5mmol/L 二甲雙胍處理；二甲雙胍中劑量組為1mmol/L 二甲雙胍處理；二甲雙胍高劑量組為2mmol/L 二甲雙胍處理；DMSO 為二甲基亞砜；與DMSO 組比較，aP＜0.05

4 討論

缺血性腦卒中是因腦動脈血栓梗塞而造成的一種高致死率、高致殘率的腦血管疾病，溶栓是缺血性腦卒中的重要治療手段[1]。然而，溶栓后的CIRI 會加重疾病進展的可能。研究發現，CIRI 的發生涉及多個病理機制，如氧化應激損傷、炎癥因子損傷、鈣超載等，其中氧化應激是其最為核心的致病機制[6-8]。在CIRI 的病理過程中，氧化應激會產生大量的ROS，破壞細胞的正常功能，降低多種氧化酶的活性，造成脂質、蛋白質和DNA 等的損傷，最終誘導腦細胞凋亡甚至腦組織壞死[8]。因此，使用抗氧化劑清除ROS 是治療CIRI 的一種重要手段。

研究表明，抗氧化劑能夠通過激活抗氧化信號通路，上調抗氧化蛋白表達來清除ROS。其中Nrf2/ARE 是重要的抗氧化信號通路之一，抗氧化劑刺激后，Nrf2 與胞漿蛋白伴侶分子Keap1 解耦聯合后進入細胞核，與抗氧化反應元件ARE 結合，啟動HO-1等蛋白表達間接清除ROS[9]。本實驗結果發現，當不同濃度的二甲雙胍（0.5、1 和2mmol/L）作用PC12 細胞后，其對PC12 細胞未表現毒害作用，低中濃度下對PC12 細胞的細胞活力具有輕微的促進作用。因此，本研究選用該三組藥物濃度進行后續的研究。研究表明，H2O2通過增加ROS 的產生而誘導氧化應激損傷，因此我們建立H2O2誘導PC12 細胞損傷模型研究二甲雙胍的抗氧化作用。我們發現相對于DMSO 組，H2O2處理組的細胞生存率明顯降低，當二甲雙胍和H2O2共同作用下，細胞生存率呈濃度依賴性提高。研究發現，H2O2能夠誘導細胞凋亡，破壞細胞膜結構，導致氧化應激相關酶LDH 釋放[10]。本研究結果發現，H2O2處理PC12 細胞后，細胞的凋亡率提高，但二甲雙胍處理后能夠降低細胞凋亡率。二甲雙胍濃度依賴性地降低LDH 的釋放，同時，二甲雙胍能夠降低PC12 細胞內ROS 水平，說明二甲雙胍通過降低ROS 水平抑制細胞凋亡和減少LDH 釋放起到細胞保護作用。研究結果表明，二甲雙胍夠濃度依賴性地提高Nrf2 和HO-1 mRNA 和蛋白水平，沉默Nrf2 后，二甲雙胍可降低H2O2誘導的細胞損傷，提示二甲雙胍可能通過激活Nrf2/HO-1 通路起到細胞保護作用。

綜上所述，二甲雙胍可能是一個Nrf2 誘導劑，其通過激活Nrf2/HO-1 通路對H2O2誘導的PC12 細胞損傷起到保護作用。