電針水溝穴對腦梗死模型大鼠腦血管平滑肌Calponin 和Caldesmon 表達的影響

李 蕾 張 瀲 范立紅 周莎白 趙 晶 歐陽侃

腦梗死又稱缺血性腦卒中，是臨床常見的難治性疾病，改善腦循環是治療腦梗死的關鍵環節，調節血管平滑肌收縮是目前研究的熱點[1]。腦血管平滑肌鈣樣蛋白（Calponin）和鈣調結合蛋白（Caldesmon）是缺血狀態下調節血管平滑肌收縮運動的重要信號通路因子[2]。本研究采用腔內線栓法阻滯大鼠左側大腦中動脈，制備腦梗死模型，以水溝穴作為醒腦開竅針刺法的主穴，研究電針對腦梗死大鼠腦血管平滑肌Calponin、Caldesmon 表達的影響，探討電針治療腦梗死作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雌性Wistar 大鼠78只，體質量（180±10）g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2018-0006。由浙江中醫藥大學動物實驗中心飼養，采用代謝籠適應性喂養1 周。普通飼料喂養，自由飲水。動物飼養環境設置：室溫24℃，濕度45%～75%。實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2018-0012，本實驗經浙江中醫藥大學倫理委員會審核通過（批號IACUC-2018121706）。

1.2 主要試劑及儀器 Calponin 抗體（Abcam 公司，美國，批號46794）；Caldesmon 抗體（Abcam 公司，美國，批 號32330）；Goat anti-Rabbit IgG Antibody（biosharp 公司，中國，批號BL003A）；RIPA 裂解液（批號P0013D）、BCA 試劑盒（批號P0011）購自上海碧云天生物技術公司；ECL 發光試劑盒（Merck Millipore 公司，美國，批號1822101）；激光多普勒血流儀（瑞典百靈威中國公司，型號：Periflux System 5000）；康嶺電針儀（揚州康嶺醫用電子儀器有限公司，型號：G91-E）；高速冷凍離心機（德國Eppendorf AG 公司，型號：5427R）；數碼凝膠圖像分析處理系統（上海天能科技有限公司，型號：GIS－2008）。

1.3 動物分組及模型建立 78 只大鼠，手術前禁食12h，采用隨機數字表法分為空白組6 只，模型組、電針組、假手術組各24 只。造模方法[3]：將大鼠置于仰臥位，腹膜內注射10%水合氯醛（3mL/kg 體質量）。沿頸部正中偏左側切口，依次分離出左側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，然后在頸總動脈近心端、頸外動脈和頸內動脈分叉處放置動脈夾。在兩動脈夾之間用1mL 注射器扎一個小孔，選擇直徑為0.204mm的尼龍線栓插入小孔，插入后放開頸外動脈和頸內動脈分叉處動脈夾，接著繼續插入線栓，總計長度為18～22mm，線栓進入頸內動脈至稍遇阻力即停止進線，結扎線栓。假手術組大鼠除不插入線栓外，其余步驟相同；空白組大鼠除同樣抓取固定外，不做任何處理。

1.4 干預方法 電針組大鼠水溝穴定位以實驗針灸穴位標準為基礎[4]，使用“華佗牌”毫針刺入大鼠鼻中隔2mm，并在該部位下約2mm 處刺入一針作為參考電極，水溝穴接電針儀的正極，參考電極接負極，用15Hz、1mA、連續波電刺激持續20min。模型組、假手術組、空白組大鼠在相應時間段內，同樣抓取固定，不進行電針干預。

1.5 標本取材 模型組、電針組和假手術組大鼠分別于造模后0.5、1、3、6h 各處死6 只，空白組大鼠于6h 后處死。分別剝離大鼠大腦，在外科顯微鏡下分離和剪取梗死側的大腦動脈。

1.6 免疫印跡法觀察大鼠腦血管平滑肌Calponin 和Caldesmon 表達 用RIPA 裂解液抽提蛋白，采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度測定后，各樣品取20μg，加等量樣本處理液后，100℃煮沸5min，Calponin 采 用12% SDS－PAGE 變 性 電 泳，Caldesmon 采用8% SDS－PAGE 變性電泳，經電轉移方式轉置硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST 液封閉2h，而后加入含一抗的封閉液（Calponin抗體稀釋度1∶5000；Caldesmon 抗體稀釋度1∶6000）4℃恒溫室搖床孵育過夜，洗去抗體后加入含二抗的封閉液（比例1∶2000），室溫搖床作用1～2h。洗去抗體后按ECL 發光試劑盒說明依次進行化學發光，顯影，定影。將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統分析目標帶的凈光密度值。

1.7 統計學方法 應用SPSS 22.0 軟件進行數據統計分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較行LSD 檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腦血管平滑肌Calponin 表達水平比較與假手術組比較，模型組大鼠1、3、6h Calponin 表達下調，差異有統計學意義（P 均＜0.05）；與模型組比較，電針組大鼠3、6h Calponin 表達上調（P 均＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠腦血管平滑肌Calponin 表達水平比較（±s）

表1 各組大鼠腦血管平滑肌Calponin 表達水平比較（±s）

注：電針組給予水溝穴電針干預；模型組插線栓不電針；空白組和假手術組僅抓取固定，不進行電針干預；Calponin 為肌鈣樣蛋白；“-”為無此項數據；與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

2.2 各組大鼠腦血管平滑肌Caldesmonn 表達水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠1、3、6h Caldesmonn 表達下調，差異有統計學意義（P 均＜0.05），與模型組比較，電針組大鼠1、3、6h 表達均上調（P 均＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腦血管平滑肌Caldesmon 表達水平比較（±s）

表2 各組大鼠腦血管平滑肌Caldesmon 表達水平比較（±s）

注：電針組給予水溝穴電針干預；模型組插線栓不電針；空白組和假手術組僅抓取固定，不進行電針干預；Caldesmon 為鈣調結合蛋白；“-”為無此項數據；與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

3 討論

研究表明，缺血性中風患者急性期進行針刺治療可抑制炎性因子產生，起到保護腦組織、恢復腦細胞神經功能的作用[5-6]。針刺亦可以通過調節腦血管舒縮，達到促進腦循環而治療腦梗死的效果[7]。

水溝穴是“醒腦開竅”針法的重點穴位，針刺水溝穴可有效治療中風。研究表明，針刺水溝可以改善腦循環，促進建立側支循環，并能抑制腦神經細胞的凋亡[8-9]。針刺大腦中動脈閉塞模型（middle cerebral artery occlusion model，MCAO）大鼠水溝穴，可以下調蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）水平和活性，緩解大腦中動脈平滑肌痙攣[10]。不同頻率電針刺激水溝穴具有調控大鼠血腦屏障通透性的效應，可抑制大腦皮層毛細血管內皮細胞的表達[11]。本研究結果顯示，經水溝穴電針干預，電針組模型大鼠Calponin、Caldesmon 表達均呈上調（P＜0.05）。

PKC-δ 是一種炎癥調節因子，它可以調節核轉錄因子（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）和促炎基因如白細胞介素-1β、白細胞介素-6 表達，激活細胞因子和趨化因子的分泌[12]。Calponin、Caldesmon是存在于腦血管平滑肌中的重要收縮抑制蛋白，腦缺血時PKC 激活，Calponin、Caldesmon 磷酸化，不再抑制三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶活性，促使血管平滑肌持續收縮，進一步導致缺血性腦損害[13-14]。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組Calponin、Caldesmonn 表達下調（P＜0.05），而與模型組相比，電針組Calponin、Caldesmonn 表達上調（P＜0.05），表明經過電針干預后大鼠腦血管平滑肌Calponin 和Caldesmon 蛋白表達下調延緩。

綜上所述，電針水溝穴可以抑制腦梗死大鼠腦血管平滑肌收縮關鍵蛋白Calponin、Caldesmon 下調，推測電針水溝穴通過改善腦梗死模型大鼠腦血管平滑肌收縮，從而達到治療腦梗死的作用。