N6-甲基腺苷甲基化對小鼠腦缺血-再灌注損傷中微小核糖核酸-155表達和腦損傷的調控作用

何欣燃，王黎洲，許 敏，安天志，周 石，李 興

作者單位：550004 貴陽 貴州醫科大學醫學影像學院

目前急性缺血性腦卒中的主要治療方式是靜脈溶栓和血管內介入治療，如血管內機械取栓、動脈溶栓和動脈成形術［1］。然而研究表明，血管成功再通仍可發生腦缺血-再灌注損傷（cerebral ischemiareperfusion injury，CIRI），造成更為嚴重的腦組織結構和功能損害［2］。因此，探究CIRI 潛在分子機制，開發新的治療靶點以減輕腦損傷，是當前缺血性腦卒中研究的主要目標。目前已報道微小核糖核酸（microRNA，miRNA，miR）在慢性心血管或腎臟疾病過程中的作用［3］。有研究發現信使RNA（mRNA）和長非編碼RNA，與DNA 和組蛋白相似，可被化學修飾，最為重要的是mRNA 轉錄后調控可影響關鍵蛋白表達和腦功能［4］。RNA 最豐富的內部化學修飾N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）是mRNA穩定性、蛋白表達和其他數個細胞過程的關鍵調節因子［5］，m6A 上的pri-miRNA 可擾亂miRNA 成熟［6］。近期研究表明mRNA 上m6A 修飾是可逆的，并受催化甲基轉移酶如甲基轉移酶樣蛋白（methyltransferase like protein，METTL）3、METTL4、METTL14 等催化［7］。本課題組前期研究結果證實miR-155 表達與腦部神經元凋亡呈負相關［8］，但CIRI 過程中調控miR-155 表達的上游機制即m6A 甲基化是如何調控primiRNA，從而調控miR-155 集中尚未闡明。本研究旨在探討m6A 修飾與miR-155 表達水平在CIRI形成過程中的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞和動物

小鼠腦神經瘤母細胞（N2a）及293T 細胞均購自湖南豐暉生物科技公司。本研究采用的實驗方案已獲貴州醫科大學動物實驗倫理委員會批準，并按照動物實驗指南進行。所用動物為8月齡C57BL/6雄性C57BL/6 小鼠，體質量20～25 g。術前小鼠在12 h 光照和12 h 黑暗條件、控制溫度（21±2）℃、控制濕度60%～75%環境中飼養1 周，保證充足的實驗室飼料和水。

1.2 主要實驗試劑

miR-155 過表達質粒（上海吉凱基因醫學科技公司），TRIzol 試劑、磷酸緩沖液（PBS）（美國Thermo Fisher 科技公司），β- 肌動蛋白（actin）內參抗體、miR-155 mimics、miR-155 inhibitor（英國Abcam 公司），DL5000 marker、DL2000 marker、限制性內切酶（日本TaKaRa 公司），質粒小量提取試劑盒（北京索萊寶科技公司），DH5α 感受態細胞（北京擎科生物科技公司）。

1.3 小鼠CIRI 建立和實驗動物分組

實驗組小鼠接受頸內動脈線栓法構建大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型［9］，建模成功24 h 后開始實驗；假手術組小鼠麻醉后，不置入線栓，不阻塞大腦中動脈，其余手術步驟與實驗組相同。手術過程中及結束后均使用37℃恒溫電熱板維持小鼠體溫，直至其完全蘇醒。共分為7 組，分別為假手術組（sham）、缺血-再灌注模型組（MCAO）、缺血-再灌注模型右側腦室注射對照組（LV-NEG）、缺血-再灌注模型右側腦室注入miR-155 過表達組（LV-miR-155）、缺血-再灌注模型右側腦室注入對照質粒組（LV-minics）、缺血-再灌注模型右側腦室注入METTL3 高表達質粒組（LVMETTL3）、缺血-再灌注模型右側腦室注入METTL3沉默表達質粒組（LV-METTL3-inhibitor），每組各6只鼠。

1.4 實時定量聚合酶鏈反應檢測

采用TRIzol 法從處死小鼠腦組織提取RNA，以39 μL 焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水稀釋1 μL RNA（1∶40 稀釋），NanoDrop 儀測定樣品濃度和純度，A260/A280 比值應在1.6 以上。總RNA 逆轉錄。取聚合酶鏈反應（PCR）混合液20 μL，轉移至各孔中；將PCR 板裝入實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）儀，按照如下程序運行：95℃2 min，95℃5 s，60℃30 s，95℃5 s，循環次數40 次。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，并用Image-Pro Plus 圖像分析軟件計算吸光度值，以與3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）相對值記錄結果。2-△△Ct 法分析基因相對表達［10］，計算公式：ΔΔCT＝ΔCt（MCAO 組）-ΔCt（對照組）。引物序列（蘇州金唯智生物科技有公司）如下：miR-155-F：5′-GCTTCGGTTAATGCTAATCGTG-3′；miR-155-R：5′-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3′；GAPDH 上游引物5′-GGCAAGTTCAACGGCACAG-3′，下游引物5′-ACGCCAGTAGACTCCACGAC-3′。

1.5 慢病毒轉染檢測

為了構建帶His 標簽的慢病毒表達載體，采用PCDH 載體系列行目的基因miR-155 和METTL3 過表達，PLKO 系列行目的基因miR-155 和METTL3敲除。質粒合成由外包公司合作完成。采用293T 細胞進行慢病毒包裝，大腸桿菌DH5α 行擴增慢病毒包裝的質粒。細胞準備好后取5～10 μg/mL 聚凝胺作為轉染濃度，轉染后24 h 吸取慢病毒轉染液中原有培養基，加入新鮮培養基繼續培養24 h，加入2 μg/mL 嘌呤霉素行選擇性培養細胞24 h，共計培養3 代即可得到含有慢病毒表達質粒的細胞；將轉染慢病毒載體的細胞通過胰酶進行消化，然后加入人工腦脊液中，注射至小鼠右腦室；轉染后5 d 行造模檢測，RT-qPCR 檢測轉染結果。

1.6 蛋白質印跡分析

細胞裂解液PBS 對小鼠右腦組織樣本進行裂解，4℃、12 000×g離心2～3 min，收集上清液，Bradford 法檢測相關蛋白濃度；蛋白質經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上；按蛋白印跡位置剪開PVDF 膜，每張膜加入一抗稀釋液2 mL；含一抗溶液的封閉液滴加于搖床塑料膜上，將Western 膜從封閉液中取出，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，4℃靜置過夜；一抗試劑孵育結束后，用含Tween?20 磷酸鹽緩沖液（PBST）對膜再次清洗，將二抗試劑按1∶1 000 比例加入膠體溶液中，將膜與一抗在4℃孵育過夜，然后與偶聯的二抗在室溫下孵育2 h；PBST 對膜再次清洗；最后置于Super ECL Plus 超敏發光液中2 min，凝膠成像儀中成像。Image Lab 軟件分析蛋白條帶灰度值，β-actin 作為對照，室溫下在中封閉1 h 后，通過增強化學發光檢測試劑盒顯示目標蛋白條帶。

1.7 數據分析

采用SPSS 20.0 軟件對所有數據進行統計學分析，所有數值均取3 次獨立實驗±s，統計分析用t檢驗，非正態分布數據用非參數檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MCAO 模型腦細胞中miR-155 表達水平

RT-qPCR 檢測顯示，MCAO 組小鼠腦組織細胞中pri-miR-155 表達水平與sham 組相比顯著降低（P=0.009），但pre-miR-155、miR-155 表達顯著升高（P=0.007、0.000 8），見圖1。

圖1 MCAO 組和sham 組小鼠腦組織中miR-155 表達水平

2.2 METTL 復合物在MACO 模型中表達水平

建模24 h 檢測顯示，MACO 模型鼠右腦組織細胞中METTL3、miR-155 表達水平均升高（P＜0.05）（圖2①），METTL3 蛋白表達水平隨miR-155 劑量增加而升高（圖2②），但METTL14 mRNA 與腎母細胞瘤1 相關蛋白（WTAP）mRNA 表達水平，差異均無統計學意義（P＞0.05）（圖2③）

圖2 METTL3、METTL14 及WTAP 在MACO 模型中表達水平分析

2.3 METTL3 過表達對miR-155 水平的影響

慢病毒過表達質粒LV-METTL3 組細胞中METTL3 過表達與對照質粒LV-minics 組相比，使pri-miR-155 表達水平顯著降低（P=0.008），同時升高pre-miR-155 和miR-155 表達水平（P=0.04、0.009），差異均有統計學意義（圖3）。

圖3 METTL3 過表達對小鼠CIRI過程中miR-155 水平的影響

2.4 METTL3 低表達對miR-155 水平的影響

慢病毒沉默表達質粒LV-METTL3-inhibitor 組細胞中METTL3 沉默表達與對照質粒LV-minics 組相比，顯著升高pri-miR-155 表達水平（P=0.006），同時降低pre-miR-155、miR-155 表達水平（P=0.03、0.009），差異均有統計學意義（圖4）。

圖4 沉默表達METTL3 對小鼠CIRI 過程中miR-155 水平的影響

3 討論

近年來，m6A 修飾成為表觀遺傳研究熱點。m6A 修飾參與哺乳動物許多生物學過程，如RNA剪接、蛋白質翻譯和干細胞更新［11］。Li 等［12］研究報道m6A 上METTL3 可通過與翻譯起始密碼子相互作用促進翻譯，進一步影響癌細胞生長、存活和侵襲。Visvanathan 等［13］研究顯示，METTL3 介導的m6A修飾在神經膠質瘤細胞維持和去分化中具有關鍵作用，揭示了METTL3 作為膠質母細胞瘤治療中潛在分子靶點的基本作用。上述研究雖然證實METTL3 在腫瘤細胞中的重要調節機制，但目前尚無針對CIRI 過程中M6A 修飾影響的報道，也很少有研究關注METTL3 在CIRI 發生中的潛在機制［14］，因此本研究探討METTL3 在CIRI 中對miR-155 是否存在調控作用。

有研究報道，miR-155 體內表達能顯著改善腦缺血癥狀，增加血管內皮通透性［3］。有研究證實miR-155 表達水平變化與腦損傷程度密切相關，miR-155 表達升高與腦損傷程度加劇相關［15］。Wang等［16］研究發現，抑制腦細胞中miR-155-5p、pri-miR-155 和pre-miR-155 表達，可改善大鼠腦缺血損傷程度，提示miR-155 可能是一種新型腦血管病治療劑。該結論為本研究結果提供了強有力佐證，表明miR-155 在腦損傷中具有重要作用。本課題組先前研究發現miR-155 在CIRI 過程中異常表達［8］。本研究將pri-miR-155 中異常m6A 修飾與CIRI 發生和發展聯系起來，結果提示MCAO 模型小鼠腦組織細胞中miR-155 水平可能是pri-miR-155 加工和成熟異常造成的。

m6A 在miRNA 成熟過程中起到關鍵的調控作用。m6A 甲基轉移酶復合物由METTL3、METTL14和WTAP 組成，其中METTL3 過表達能增強pri-miR中m6A 修飾，并加速其向miRNA 成熟［17］。本研究結果輔證了這一觀點，證實MCAO 建模24 h 小鼠右腦中METTL3 和miR- 155 表達均顯著增高，METTL3 蛋白表達也隨miR-155 劑量增加而顯著增加，但METTL14 和WTAP 并無顯著差異；了解到METTL3 和miR-155 表達水平呈正相關后，為進一步探究METTL3 表達對pri-miR-155 和pre-miR-155表達的影響，又分別構建METTL3 高表達和低表達小鼠模型，最終發現METTL3 表達升高能促進premiR-155 成熟，從而導致miR-155 表達水平升高。

本研究結論認為，CIRI 過程中METTL3 表達升高可促進pre-miR-155 成熟，進而升高miR-155 表達水平。這可能為未來缺血性腦卒中患者提供一新治療策略。