結直腸癌肝轉移患者TACE治療后含表皮生長因子的纖維蛋白樣細胞外基質2水平及意義

于清泳，趙 輝

作者單位：226699 江蘇南通 海安市中醫院介入科（于清泳）；南通大學附屬醫院介入科（趙 輝）

結直腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤之一，易發生肝臟轉移［1］。據調查60%～71%的結直腸癌發生了肝臟轉移，其中僅有10%～20%結直腸癌肝轉移患者可通過根治性手術切除進行治療［2-3］。近年來，隨著介入技術的發展，TACE 已被用于治療結直腸癌肝轉移，但整體治療效果仍不理想，患者5年生存率仍較低［4］。探尋結直腸癌肝轉移TACE 治療預后的生物標志物，可了解患者生存預后情況，有利于治療方案的制定。

含表皮生長因子的纖維蛋白樣細胞外基質2（EGF containing fibulin-like extracellular matrix protein 2，EFEMP2）又名fibulin4，是fibulin 家族中一員，主要負責調控彈性纖維的合成與排列［5-6］。目前，EFEMP2 已被證實在結直腸癌中異常表達，并參與其進展［7］。有研究證實上調EFEMP2 可抑制腫瘤細胞的遷移、侵襲和上皮間質轉化［8-10］。上皮間質轉化與TACE 治療療效密切相關。本研究分析EFEMP2和結直腸癌肝轉移TACE 治療預后的關系。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選擇2015年3月至2017年7月在海安市中醫院接受治療的152 例結直腸癌肝轉移患者作為研究對象。納入標準：①經臨床病理及影像學檢查確診為結直腸癌肝轉移；②無法通過根治性手術切除或不接受根治性手術切除治療；③接受TACE 治療后未再次接受TACE 治療；④臨床治療、檢查及隨訪等資料完整。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②存在除肝臟以外其他臟器轉移的腫瘤病灶；③心、肝、腎功能嚴重異常；④接受放療、免疫治療或靶向治療等；⑤有自身免疫性疾病史或血液系統疾病；⑥臨床資料不完整、不配合完成檢查或隨訪失聯等。152 例結直腸癌肝轉移患者中男94 例，女58例，年齡52～70（61.6±4.3）歲；腫瘤單發52 例，腫瘤多發100（2～3 個）例，共268 個腫瘤病灶，腫瘤平均直徑（3.28±0.44）cm。

收集所有受試者年齡、性別、原發病灶位置、轉移灶個數、Child-Pugh 分級、腫瘤直徑、AFP 和后續治療方案等信息。采用電話、復診等方式進行隨訪，了解預后情況。于患者出院后開始隨訪，每月隨訪1次，末次隨訪時間為2020年7月10日，隨訪終點為患者隨訪過程中死亡或至末次隨訪結束，中位隨訪時間為20（6～36）個月。

1.2 方法

1.2.1 TACE 治療方法 采取仰臥位，消毒，鋪巾，麻醉；血管造影下Seldinger 法置入導管鞘及導管，注入碘帕醇（上海博萊科信誼藥業有限責任公司，國藥準字：H20073014），觀察腫瘤病灶位置、大小、數量和供血動脈等，灌注化療藥物并進行栓塞。化療藥物為奧沙利鉑（江蘇奧賽康藥業股份有限公司，國藥準字：H20064296）、雷替曲塞（南京正大天晴制藥有限公司，國藥準字：H20090325）和鹽酸吡柔比星（深圳萬樂藥業有限公司，國藥準字：H10930105），栓塞劑為碘化油（煙臺魯銀藥業有限公司，國藥準字：H37022398）和明膠海綿顆粒［杭州艾力康醫藥科技有限公司，國食藥監械（準）字2014 第3771056 號］。根據患者情況給予保肝、止吐等治療。TACE 后定期復診，行CT/MRI 檢查觀察腫瘤病灶碘油沉積及有無新發腫瘤病灶等情況［11］。

1.2.2 EFEMP2 水平檢測 抽取所有受試者TACE前（T0）、術后3 d（T1）、7 d（T2）和14 d（T3）空腹外周靜脈血10 mL，外周血中單個核細胞用Ficoll 密度梯度離心法分離［12］。用蛋白質印跡法檢測單個核細胞中EFEMP2 水平［13］。用RIPA 裂解液裂解單個核細胞，分離出總蛋白，用BCA 法蛋白定量；10%SDS-PAGE 分離膠凝膠電泳至溴酚藍跑出膠面，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；分別滴加兔抗人EFEMP2 單克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）和兔抗人β-actin 單克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司），4℃孵育過夜；滴加山羊抗兔二抗（上海信裕生物科技有限公司），室溫下孵育2 h；ELC 發光液顯影。用Image J 軟件讀取實驗結果圖像。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 兩組EFEMP2 水平比較

根據結直腸癌肝轉移患者3年生存預后將其分為兩組：生存組（n=51）和死亡組（n=101）。兩組EFEMP2 水平比較，差異有時間效應（F=1733.269，P＜0.001）、組間效應（F=229.065，P＜0.001）和交互效應（F=57.263，P＜0.001）。兩組EFEMP2 水平均隨時間進展呈升高趨勢。生存組T1、T2 和T3 時EFEMP2 水平均高于死亡組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

圖1 兩組EFEMP2 的蛋白質免疫印跡圖

表1 兩組EFEMP2 水平比較±s

表1 兩組EFEMP2 水平比較±s

分組例數T0T1T2T3生存組 51 0.13±0.030.35±0.060.59±0.09 0.75±0.10死亡組 101 0.13±0.030.31±0.040.46±0.08 0.57±0.08 t 值0.5814.4019.57112.014 P 值0.562＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 EFEMP2 診斷結直腸癌肝轉移TACE 治療預后的效能

T0-EFEMP2 診斷結直腸癌肝轉移TACE 治療預后的ROC 曲線下面積（AUC）、最佳截斷點、靈敏度和特異度分別為0.524（95%CI：0.425～0.622）、0.08、99.01%和11.76%；T1-EFEMP2 診斷結直腸癌肝轉移TACE 治療預后的ROC AUC、最佳截斷點、靈敏度和特異度分別為0.697（95%CI：0.601～0.793）、0.33、79.21%和54.90%；T2-EFEMP2 診斷結直腸癌肝轉移TACE 治療預后的ROC AUC、最佳截斷點、靈敏度和特異度分別為0.876（95%CI：0.814～0.939）、0.51、78.22%和84.31%；T3-EFEMP2診斷結直腸癌肝轉移TACE 治療預后的ROC AUC、最佳截斷點、靈敏度和特異度分別為0.922（95%CI：0.881～0.964）、0.60、72.30%和92.20%。T3-EFEMP2診斷結直腸癌肝轉移TACE 治療預后的效能高于T0-EFEMP2 和T1-EFEMP2，差異均有統計學意義（Z=7.549、4.187，P＜0.001）。見圖2。

圖2 EFEMP2 診斷結直腸癌肝轉移TACE 治療預后的ROC 曲線

2.3 兩組基線資料比較

以T3-EFEMP2 診斷結直腸癌肝轉移TACE 治療預后的最佳截斷點將其分為兩組：高EFEMP2 組（n=61）和低EFEMP2 組（n=91）。兩組的年齡、性別、病灶位置、轉移灶個數、Child-Pugh 分級、腫瘤直徑、AFP 和靶向治療方面比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組基線資料比較

2.4 兩組生存情況比較

高EFEMP2 組中位生存時間為36 個月，高于低EFEMP2 組（16 個月），差異有統計學意義（Log-Rank χ2=66.064，P＜0.001）。見圖3。

圖3 兩組生存曲線

2.5 結直腸癌肝轉移預后的Cox 回歸分析

將結直腸癌肝轉移患者3年生存預后作為因變量，將年齡、性別、原發病灶位置、轉移灶個數、Child-Pugh 分級、腫瘤直徑、AFP、靶向治療和T3-EFEMP2 作為自變量，分別納入Cox 單因素分析，結果顯示靶向治療和T3-EFEMP2 與結直腸癌肝轉移TACE 治療3年生存預后有關（P＜0.05）。將結直腸癌肝轉移患者3年生存預后作為因變量，按P＜0.1 的標準將Child-Pugh 分級、靶向治療和T3-EFEMP2作為自變量，納入Cox 多因素分析，結果顯示靶向治療和T3-EFEMP2 均是結直腸癌肝轉移TACE 治療3年生存預后的獨立保護因素（P＜0.05）。見表3。

表3 結直腸癌肝轉移預后的Cox 回歸分析

2.6 T3-EFEMP2 與結直腸癌肝轉移TACE 治療3年生存預后的關系

用限制性立方樣條擬合Cox 回歸分析T3-EFEMP2 與結直腸癌肝轉移TACE 治療3年生存預后的關系，當節點個數為4 時，AIC 值最小（AIC=854.907），此時結果顯示T3-EFEMP2 與結直腸癌肝轉移TACE 治療3年生存預后有關（χ2=49.2，P＜0.001），呈非線性關系（χ2=6.0，P=0.0499）。以T3-EFEMP2 診斷結直腸癌肝轉移TACE 治療預后的最佳截斷點做為參考點，當T3-EFEMP2＜0.60 時，結直腸癌肝轉移TACE 治療3年預后不良風險增加；當T3-EFEMP2＞0.60 時，結直腸癌肝轉移TACE 治療3年預后不良風險降低。見圖4。

圖4 T3-EFEMP2 與結直腸癌肝轉移TACE 治療3年生存預后的限制性立方樣條圖

3 討論

有極性的上皮細胞通過特定程序轉化成有活動能力的間質細胞的過程即為上皮間質轉化，進而促使細胞的遷移和侵襲，降低放、化療療效［14-15］。Kang 等［8］研究證實，EFEMP2 高表達可抑制乳腺癌細胞遷移、侵襲和上皮間質轉化等。Zhou 等［9］研究證實EFEMP2 可調控膀胱癌細胞的上皮間質轉化。Song 等［10］研究證實上調EFEMP2 水平可抑制肺癌細胞的侵襲、遷移和上皮間質轉化。目前，陳勇［16］研究證實EFEMP2 在結直腸癌肝轉移病灶中低表達，但關于其與TACE 治療療效的關系鮮見報道。

本研究結果顯示生存組和死亡組EFEMP2 水平均隨時間進展呈升高趨勢，此外，生存組T1、T2和T3 時EFEMP2 水平均高于死亡組，上述結果表明EFEMP2 水平可能與結直腸癌肝轉移TACE 治療預后有關，其表達水平或可評價患者預后。遂構建了EFEMP2 診斷結直腸癌肝轉移TACE 治療預后的ROC 曲線，結果顯示T3-EFEMP2 診斷結直腸癌肝轉移TACE 治療預后的ROCAUC、靈敏度和特異度分別為0.922、72.30%和92.20%，其診斷效能高于T0-EFEMP2 和T1-EFEMP2，上述結果表明T3-EFEMP2 評價結直腸癌肝轉移TACE 治療預后的效能高，但靈敏度偏低，可輔助評價結直腸癌肝轉移TACE 治療預后。

本研究進一步探究了EFEMP2 與結直腸癌肝轉移TACE 治療預后的關系，結果顯示高EFEMP2組中位生存時間高于低EFEMP2 組，表明EFEMP2與結直腸癌肝轉移TACE 治療后的生存時間有關，可用于預后評估。葉濤等［17］研究證實結直腸癌肝轉移的女性患者預后較男性患者好。魯全芝［18］研究表明肝轉移病灶數目是結直腸癌肝轉移預后的獨立危險因素。為避免混雜因素影響分析結果，本研究用Cox 回歸分析影響結直腸癌肝轉移TACE 治療預后的因素，結果顯示靶向治療和T3-EFEMP2均是結直腸癌肝轉移TACE 治療3年生存預后的獨立保護因素，而性別、肝轉移病灶數目均與結直腸癌肝轉移TACE 治療3年生存預后無關，與上述研究結果存在出入，推測其差異可能與納入研究樣本量、隨訪時間及納排標準等有關，后續還需開展大樣本、多中心研究驗證本研究結論。

人體EFEMP2 基因位于染色體11q13，該區域的易位、重排及擴增等均與惡性腫瘤發生、發展有關［19］。現有研究已表明EFEMP2 可調控Wnt/β-catenin 信號傳導通路參與多數惡性腫瘤細胞的遷移、侵襲和上皮間質轉化［8-9］。本研究推測EFEMP2 可能通過上述調節機制參與了結直腸癌肝轉移細胞的上皮間質轉化過程，進而影響了TACE 治療療效。受化療藥物影響，若癌細胞的上皮間質轉化能力降低，EFEMP2 水平高；反之，EFEMP2 水平低。因此，檢測其水平可反映結直腸癌肝轉移TACE 治療預后，是以T3-EFEMP2 與結直腸癌肝轉移TACE 治療3年生存預后有關，當T3-EFEMP2＜0.60 時，結直腸癌肝轉移TACE 治療3年預后不良風險增加；當T3-EFEMP2＞0.60 時，結直腸癌肝轉移TACE 治療3年預后不良風險降低。

綜上所述，直腸癌肝轉移患者外周血單個核細胞中EFEMP2 水平與TACE 治療療效有關，其水平低提示TACE 治療臨床獲益較小。本研究樣本量較小、隨訪時間偏短，且檢測EFEMP2 水平的時點偏少，下一步將開展大樣本、多中心研究，增加檢測EFEMP2 的時點，完善本研究內容。