奶豆腐中乳酸菌的分離鑒定及風味特性研究

洋洋，烏有娜，雙全，王玉榮，郭壯

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，呼和浩特010018；2.湖北文理學院食品科學技術(shù)學院，湖北襄陽441053）

0 引言

內(nèi)蒙古傳統(tǒng)奶豆腐是蒙古族、哈薩克族等少數(shù)民族喜歡食用的一種傳統(tǒng)乳制品，蒙語可稱為“Hurood”[1-2]，奶豆腐是以羊奶或者是牛奶中本身的環(huán)境中的微生物自然發(fā)酵而形成的[3]。當然在制作傳統(tǒng)奶豆腐中乳酸菌時候發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4]。另外奶豆腐的營養(yǎng)價值較高，但人們對于傳統(tǒng)乳制品的消費是甚少[5]，主要原因是奶豆腐的感官品質(zhì)[6]較差。研究發(fā)現(xiàn)，奶豆腐中的微生物主要包括乳酸菌[7-9]、霉菌[10-11]、酵母菌[12]等3大類群，其中乳酸菌對傳統(tǒng)奶豆腐感官品質(zhì)的改善發(fā)揮著重要的作用[13-15]。

本研究從內(nèi)蒙古錫林郭勒盟正藍旗采集奶豆腐樣品，對其中的乳酸菌進行分離鑒定，采用電子鼻和電子舌對食品的風味和滋味進行評價，以期為后續(xù)的傳統(tǒng)奶豆腐的相關(guān)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供支持。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本實驗采集的樣品來自于內(nèi)蒙古錫林郭勒盟正藍旗長虹乳制品廠，研究人員于2019年3月，在內(nèi)蒙古錫林郭勒盟正藍旗長虹乳制品廠、正藍旗各個奶食店等地區(qū)采集。將采集的樣品立即放置在低溫保存，及時帶回實驗室進行乳酸菌的分離純化等研究。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基和MRS液體培養(yǎng)基，MRS固體培養(yǎng)基和MRS液體培養(yǎng)基均由國藥集團化學試劑有限公司所提供。

試劑：提取DNA所用試劑，PCR擴增和電泳檢測所用試劑，細菌基因組DNA試劑，由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。

1.3 儀器與設(shè)備

DYY-12水平電泳儀，北京市六一儀器廠；DCodeTMSystem、UV PCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)，美國BIO-RED公司；VeritiTM 96孔梯度PCR擴增儀，美國AB公司；SA402B電子舌，武漢高科南新貿(mào)易有限公司；PEN 3電子鼻，德國Airsense公司。

1.4 乳酸菌的分離純化及保存

奶豆腐、酸馬奶等樣品中的乳酸菌計數(shù)方法是采用涂布培養(yǎng)法。奶豆腐樣品使用刀具切成粉末，稱取1 g到15 mL無菌石蕊牛乳中，37℃培養(yǎng)24 h，再用涂布平板法對樣品進行稀釋涂布，37℃培養(yǎng)48 h，獲得樣品中的不同菌落，觀察并記錄菌落形態(tài)（顏色、大小、形態(tài)等），挑取不同的特征菌落，于對應(yīng)的固體培養(yǎng)基上劃線2～3次，直至獲得純培養(yǎng)物。經(jīng)革蘭氏染色，過氧化氫酶實驗，將疑似乳酸菌的純培養(yǎng)物在30%甘油里保藏，以待后續(xù)實驗。

1.5 DNA的提取及純度的檢測

采用CTAB法提取分離菌株的基因組DNA[16]，按照MVEOBIANG-A[17]等方法提取乳酸菌總DNA在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳上跑膠檢測。

表1 PCR反應(yīng)體系[18]（25μL）及擴增程序

擴增完成之后，將PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測到，如在1 500 bp處有明亮條帶且無拖尾現(xiàn)象、即PCR擴增成功，再使用PCR清潔試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化，PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體后，進行克隆并送由武漢呢天一輝遠生物科技有限公司進行測序。

1.6 同源性分析

將測序得到的16S rRNA基因序列在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST對比，根據(jù)各個菌株的序列同源性選取相似度較高的模式菌株，再使用Mega5.0的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，再進行所分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1.7 奶豆腐的滋味和風味品質(zhì)評價

1.7.1 奶豆腐滋味品質(zhì)的評價

將奶豆腐切成粉末稱取30 g放入樣品瓶中，加等體積的純水稀釋5倍，3 000 g離心10 min，去上清夜待用。將上清夜放入樣品瓶后按照王玉榮等方法[19]使用SA402B電子舌對其鮮味、苦味、酸味、苦味和咸味及后味A（澀的回味）、后味（苦的回味）和豐度（鮮的回味）進行測定。

1.7.2 奶豆腐風味品質(zhì)的評價

將奶豆腐樣品進行預(yù)處理后，10 g放入樣品瓶中置于40℃恒溫水浴鍋中加熱30 min，參照楊成聰[20]的方法，使用PEN 3電子鼻對其風味進行評價，其中測試時間為60 s，然后取49、50、51的數(shù)據(jù)再進行分析。

1.8 數(shù)據(jù)分析

本實驗使用主成分分析對奶豆腐的滋味整體結(jié)構(gòu)的差異性分析，使用MAGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用Origin2017軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離鑒定

2.1.1 乳酸菌分離菌株的菌落形態(tài)及表型特征

根據(jù)乳酸菌的形態(tài)學特征，初步從8份樣品中共分離出33株疑似乳酸菌的菌株。在MRS固體培養(yǎng)基上菌株的菌落呈現(xiàn)中等大小不一，乳白色、邊緣整齊，有一些菌落的表面光滑，而有些粗糙，如圖1。經(jīng)革蘭氏染色實驗以及過氧化氫酶實驗反應(yīng)，即為革蘭氏陽性菌和過氧化氫酶陰性菌。將33株菌初步定為乳酸菌。

圖1 部分菌株固體培養(yǎng)基菌落形態(tài)

2.1.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和乳酸菌鑒定結(jié)果

由圖2可以看出，NDF4-3、4-5、4-5、4-10、5-1、5-5、5-6、6-1、6-2、6-3、6-5、6-8菌株與Lactobacillus delbrueckii聚為一類群，且從表2可以看出來同源性為99%，故將其鑒定為Lactobacillus delbrueckii。NDF5-2、6-4、6-6、6-7、7-3菌株與Lactobacillus fermentum聚為一類群，且同源性為99%，因此可以鑒定為Lactobacillus fermentum。NDF2-1、2-3與Enterococcus faecium聚為一類群，且同源性為99%，因此歸為Enterococcus faecium。而NDF3-1、7-1、7-2、8-1菌株與Pediococcus acidilactici聚為一類群，并且同源性為99%，所以可鑒定為Pediococcus acidilactici。NDF1-1、1-3、1-5、1-6、2-2、2-4、2-5、3-4、3-5菌株與Lactococcuslactis聚為一類群，并同源性為99%，因此鑒定Lactococcus lactis。然而NDF8-3菌株與Lactococcus garvieae聚為一類，且同源性為99%，因此可以鑒定為Lactococcusgarvieae。

圖2 基于奶豆腐中乳酸菌16SrDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 NDF1-NDF8分離菌株16SrDNA基因序列比對結(jié)果

2.2 奶豆腐滋味和風味品質(zhì)的評價

奶豆腐各滋味指標相對強度的箱型圖如圖3所示。由圖3可知，奶豆腐的滋味品質(zhì)之間是存在較大的差異，其酸味、苦味、澀味、咸味、鮮味及后味A（澀的回味）和后味B(苦味的回味)的極差值是都超過1，其中奶豆腐的苦味的組內(nèi)差異是最大的。基于傳統(tǒng)電子鼻技術(shù)，奶豆腐的風味指標的強度如表3所示。

圖3 奶豆腐不同滋味的箱型圖

由表3可知，所有奶豆腐的各風味指標之間存在著較大的差異，響應(yīng)值存在比較差異較大的傳感器為W 1S、W 5S、W 1W，其說明奶豆腐的揮發(fā)性風味物質(zhì)的主要差異是在氫氧化物和甲烷以及有機硫化物、萜類物質(zhì)上。)

表3 化學傳感器及其對應(yīng)的敏感物質(zhì)類型

3 結(jié)論

從內(nèi)蒙古錫林郭勒盟正藍旗采集了8份奶豆腐樣品，通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，共分離到了33株乳酸菌。對這些乳酸菌進行了鑒定，結(jié)果顯示它們分別屬于德式乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、糞腸球菌、乳酸乳球菌、戊糖片球菌、瑞士乳桿菌等6個菌種，歸為乳桿菌，腸球菌和片球菌3個乳酸菌屬。且奶豆腐樣品的揮發(fā)性風味物質(zhì)的主要差異是顯示在氫氧化合物、甲烷以及有機硫化物和萜類物質(zhì)上是有較大的差異，而奶豆腐中的苦味組內(nèi)差異是相對于其它滋味是較大的。